【摘要】：背景 潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸�。╥nflammatory boweldisease, IBD）的一種，其病變主要累及結(jié)腸黏膜和黏膜下層。目前，本病確切病因還不十分清楚，，遺傳、免疫、感染因素可能在本病發(fā)病中發(fā)揮重要作用，其中腸道黏膜對腔內(nèi)細(xì)菌免疫功能失調(diào)，致炎細(xì)胞因子分泌增多可能是主要的發(fā)病機(jī)制。因此明確腸道炎癥過程中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，有助于闡明UC的發(fā)病機(jī)制。 MicroRNA是一類長度約為20-25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA（nocoding RNA, ncRNA），其可通過結(jié)合靶基因3’端非翻譯區(qū)，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻制mRNA的翻譯。通過調(diào)控基因的表達(dá)，miRNA廣泛參與生命過程中一系列重要進(jìn)程，如組織器官的形成、細(xì)胞分化、增殖、凋亡、信號通路的調(diào)控、炎癥發(fā)生、腫瘤形成等等。本研究旨在探討miRNA-155及其靶基因可能在UC發(fā)病機(jī)制中的作用，為研究UC找到新的切入點。 目的 本研究利用前期UC患者和正常人結(jié)腸黏膜miRNA表達(dá)芯片，應(yīng)用生物信息學(xué)及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)等方法篩選表達(dá)差異的miRNA及其靶基因，并探討miRNA-155及其靶基因在UC腸道黏膜炎癥發(fā)展中的作用及機(jī)制，為進(jìn)一步闡明UC發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，并為尋找新的UC治療靶點提出可能的分子基礎(chǔ)。 方法 1.對前期miRNA芯片進(jìn)行分析，找出差異表達(dá)的miRNA，進(jìn)行文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，確定miR-155為主要研究對象。實時定量RT-PCR法檢測UC患者和健康對照組結(jié)腸黏膜組織中miR-155的表達(dá)差異。 2.利用Targetscan等多種軟件預(yù)測miR-155靶基因，Western blot法檢測UC患者和健康對照組結(jié)腸黏膜中靶基因FOXO3a的表達(dá)變化。構(gòu)建靶基因FOXO33’UTR表達(dá)載體和突變體，利用熒光素酶報告系統(tǒng)檢測該基因與miR-155之間的關(guān)系，并過表達(dá)和抑制表達(dá)miR-155進(jìn)一步檢測FOXO3a蛋白水平的變化。 3.在TNF-α刺激HT29細(xì)胞模型中，通過ELISA等方法檢測轉(zhuǎn)染miR-155和FOXO3a-siRNA后下游IL-8的表達(dá)變化。 結(jié)果 1.通過分析前期miRNA芯片結(jié)果及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，選擇上調(diào)顯著的miR-155進(jìn)行研究；利用實時熒光定量RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)在UC患者結(jié)腸黏膜中miR-155的表達(dá)明顯高于健康對照組。 2.通過Targetscan等生物信息學(xué)預(yù)測軟件，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a可能是miR-155的靶基因；Western blot法顯示FOXO3a蛋白水平的表達(dá)在UC組明顯低于健康對照組。 3.利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)miR-155可顯著降低FOXO33’UTR野生型組的熒光表達(dá)，而轉(zhuǎn)染突變體組表達(dá)可回升；Western blot法顯示轉(zhuǎn)染miR-155mimics組FOXO3a蛋白水平的表達(dá)明顯降低。 4.在TNF-α刺激的HT29細(xì)胞模型中，發(fā)現(xiàn)miR-155的表達(dá)隨刺激時間的延長而逐漸降低，而FOXO3a蛋白水平的表達(dá)相反；在加入FOXO3a-siRNA后，ELISA法檢測IL-8水平明顯上升；加入miR-155mimics后，IL-8水平較未加入組明顯升高。 結(jié)論 本課題通過對前期miRNA芯片結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)miR-155表達(dá)水平在UC組明顯高于健康對照組，并利用實時熒光定量PCR在結(jié)腸黏膜中進(jìn)行驗證；利用生物信息學(xué)和生物學(xué)功能鑒定等方法發(fā)現(xiàn)FOXO3a為miR-155的直接靶基因，并可能通過調(diào)節(jié)IL-8參與了UC結(jié)腸黏膜炎癥的發(fā)生發(fā)展，為進(jìn)一步深入研究UC的發(fā)病機(jī)制及治療提供了研究途徑。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R574.62

【參考文獻(xiàn)】

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1 中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會炎癥性腸病協(xié)作組;歐陽欽;胡品津;錢家鳴;鄭家駒;胡仁偉;;對我國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識意見(2007年，濟(jì)南)[J];中華消化雜志;2007年08期

本文編號：2642148