【摘要】：糖復合物(含糖蛋白,糖脂和蛋白聚糖)是繼蛋白質(zhì)和核酸研究的另一新興領(lǐng)域,其中糖蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究較為活躍。糖蛋白的聚糖部分在細胞黏附,分子運輸和清除,受體激活,信號轉(zhuǎn)導等過程中發(fā)揮重要作用。聚糖結(jié)構(gòu)變化與許多生理和病理過程相關(guān),比如惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。目前,聚糖結(jié)構(gòu)變化與疾病關(guān)系的研究已引起相當重視,如甲胎蛋白N-聚糖核心巖藻糖(AFP-L3)的變化已成為檢測肝癌的重要聚糖標志(glyco-biomarker)等。國際上糖蛋白N-聚糖的研究有較大的進展,對聚糖的整體識別和推測有一定的認識,但仍處于起步階段,對多位點N—糖基化的聚糖結(jié)構(gòu)的分析缺乏具體聚糖的結(jié)構(gòu)解析,缺少對聚糖的宏觀不均一性(糖基化位點占有率)和微觀不均一性(聚糖結(jié)構(gòu))的研究。 結(jié)合珠蛋白(Hp)是一種酸性糖蛋白,廣泛存在于人類和許多哺乳動物的血清及其他體液中,其β亞基含有四個糖基化位點,已發(fā)現(xiàn)在癌癥(如乳腺癌,胰腺癌等)發(fā)展過程中其聚糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化。本研究建立了抗體親和層析純化血清結(jié)合珠蛋白β亞基的標準方法,發(fā)明了'iTRAQ plus18O'技術(shù),利用高精度串級質(zhì)量分析儀(MALDI-QIT-TOF MS)和高分辨串聯(lián)多級質(zhì)譜系統(tǒng)(LTQOrbitrapXLETD),聯(lián)合凝集素親和印跡,對正常人(N)及肝病患者(肝炎HBV,肝硬化LC,肝癌HCC)血清中Hp-β聚糖的宏觀和微觀不均一性進行研究,確認其作為聚糖分子標志物用于肝病診斷的可能性。 第一部分肝病中血清Hp-β的糖基化位點占有率變化 本部分研究旨在建立適用于多樣本,穩(wěn)定快速的高通量糖基化位點占有率分析的方法,并以此為基礎(chǔ),分析正常人及肝病患者(HBV, LC, HCC)血清樣本中Hp-β四個糖基化位點占有率的變化,為目標糖蛋白宏觀不均一性的研究提供技術(shù)手段。 純化正常,肝炎,肝硬化,肝癌血清Hp-β，Trypsin酶解后得到的肽段中包括非糖肽和糖肽。三條糖肽分別為NLFLN207HSEN211ATAK MVSHHN184LTTGATLINEQWLLTTAK和VVLHPN241YSQVDIGLIK。本研究自行研發(fā)和應用'iTRAQ plus18O'技術(shù),采用iTRAQ和18O兩種標記方法,即iTRAQ標記非糖肽和糖肽,18O標記糖肽上的糖基化位點,將串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(Qstar XL)的母離子檢測窗口擴大至4Da,同時定量分析Hp-β蛋白和糖肽表達水平。某條糖肽的豐度值除以蛋白豐度值得到該糖肽上的糖基化位點占有率,該方法可同時完成四種樣品中目標糖蛋白的糖基化位點占有率的計算。 經(jīng)ProteinPilotTM Software (Version3.0, Applied Biosystems)分析, Qstar XL質(zhì)譜鑒定到Hp-β的13條非糖肽(95%可信度),將其豐度值的平均值作為Hp-p的蛋白水平,得到正常,肝炎,肝硬化,肝癌血清中Hp-β蛋白表達比例為6.43：2.28：1：2.84,表明其蛋白含量在肝病的進程中,呈先降低、再升高的趨勢。糖肽NLFLN207HSEN211ATAK在正常,肝炎,肝硬化,肝癌血清中的含量比例是7.29：2.49:1:2.76; MVSHHN184LTTGATLINEQWLLTTAK在正常,肝炎,肝硬化,肝癌血清中的含量比例是6.73:2.47:1:3.19; VVLHPN241YSQVDIGLIK在正常,肝炎,肝硬化,肝癌血清中的含量比例是9.11：2.37：1：4.84。通過計算得到NLFLN207HSEN211ATAK上的位點占有率比例為1.13:1.10:1:0.97(N:HBV:LC: HCC); MVSHHN184LTTGATLINEQWLLTTAK上的位點占有率比例為1.05：1.08：1:1.12(N:HBV:LC:HCC); VVLHPN241YSQVDIGLIK上的位點占有率比例為1.42:1.04:1:1.70(N:HBV:LC:HCC)。按照相對糖基化位點占有率比值(Ratio)1.5(上調(diào))或Ratio0.6(下調(diào))為標準篩選,肝癌血清中VVLHPN241YSQVDIGLIK糖基化位點占有率相比肝硬化和肝炎明顯上升,Ratio分別為1.70和1.63。 研究表明,'iTRAQplus'18O'定量技術(shù)是一種創(chuàng)新、可行的糖蛋白研究策略。相比于肝硬化和肝炎,結(jié)合珠蛋白p亞基的Asn241糖基化位點占有率在肝癌血清中顯著升高。 第二部分肝病中血清Hp-β的總N-聚糖結(jié)構(gòu)變化特征 本部分研究旨在解析人血清中Hp-β的總N-聚糖結(jié)構(gòu)。利用抗體親和層析純化血清Hp,SDS-PAGE分離Hp-p,采用PNGase F膠上酶切N-聚糖,以DHB為基質(zhì),使用MALDI-QIT-TOF MS/MS分析聚糖結(jié)構(gòu)。并進行AAL凝集素印跡分析,驗證肝病中血清Hp-β的N-聚糖結(jié)構(gòu)變化。 質(zhì)譜結(jié)果發(fā)現(xiàn),Hp-β主要含有兩天線,三天線以及巖藻糖化的聚糖結(jié)構(gòu),相比于正常和肝炎血清,肝硬化和肝癌血清中的Hp-β的巖藻糖化聚糖含量明顯升高。肝硬化和肝癌血清的Hp-p的AAL凝集素特異性結(jié)合能力比正常和肝炎高,有統(tǒng)計學差異,也說明在肝硬化和肝癌中Hp-β所含巖藻糖增多。 研究表明,MALDI質(zhì)譜在CID模式下產(chǎn)生的聚糖串聯(lián)質(zhì)譜圖可以方便高效的獲得聚糖結(jié)構(gòu)信息。Hp-p的巖藻糖化聚糖變化可作為區(qū)分肝硬化肝癌患者(LC, HCC)和肝炎患者正常人(HBV, N)的潛在標志物,說明其在肝病過程中有著重要的診斷價值。 第三部分肝病中血清Hp-β的單個糖基化位點N-聚糖結(jié)構(gòu)變化 本部分研究旨在解析人血清中Hp-p的單個糖基化位點的N-聚糖結(jié)構(gòu)。利用抗體親和層析純化不同肝病血清中Hp, SDS-PAGE分離Hp-β,采用Trypsin酶解得到糖肽NLFLN207HSEN211ATAK, MVSHHN184LTTGATLINEQWLLTTAK和VVLHPN241YSQVDIGLIK。使用LC-ESI-HCD-MS/MS獲得糖肽肽段序列和每條糖肽上含有的聚糖結(jié)構(gòu)信息。 質(zhì)譜結(jié)果發(fā)現(xiàn),Asn207和Asn211糖基化位點上有7種糖型,主要含有兩天線,三天線以及巖藻糖化的聚糖結(jié)構(gòu)。Asn184糖基化位點上有5種糖型,主要含有兩天線,三天線以及巖藻糖化的聚糖結(jié)構(gòu)。Asn241糖基化位點上有7種糖型,主要含有兩天線,三天線,四天線以及巖藻糖化的聚糖結(jié)構(gòu)。每條糖肽上的巖藻糖化聚糖結(jié)構(gòu)在肝硬化和肝癌血清中均明顯增多。 研究表明,完整糖肽的分析,可以同時獲得糖基化位點和對應的聚糖結(jié)構(gòu)信息,有重要意義。Hp-β的3條糖肽上巖藻糖化聚糖變化可以區(qū)分肝硬化肝癌患者(LC, HCC)和肝炎患者正常人(HBV, N),確認了其作為聚糖分子標志物用于診斷的可能性。 結(jié)論 1.建立'iTRAQ plus18O'定量技術(shù),并用于分析肝病中血清Hp-p四個糖基化位點占有率變化,發(fā)現(xiàn)Asn241糖基化位點占有率在肝癌血清中顯著升高。 2.分析肝病中血清Hp-p的總N-聚糖結(jié)構(gòu)變化及單個糖基化位點上的聚糖結(jié)構(gòu)變化,發(fā)現(xiàn)位于3條糖肽上的巖藻糖化聚糖結(jié)構(gòu)在肝硬化和肝癌血清中均明顯增多。 3. Asn241糖基化位點占有率和巖藻糖化聚糖含量在肝癌患者血清中顯著升高,表明Hp-p作為聚糖標志物診斷肝癌的潛在應用價值。 潛在應用價值 1.'iTRAQ plus18O'定量技術(shù)適用于多樣本的目標糖蛋白糖基化位點占有率研究,對發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)生發(fā)展中相關(guān)的異常糖蛋白有重要價值。 2.血清結(jié)合珠蛋白6亞基糖基化位點占有率和聚糖結(jié)構(gòu)變化,可能成為肝病的聚糖標志物,豐富肝病診療指標的選擇與組合。 創(chuàng)新點 1.首次建立了穩(wěn)定高效的'iTRAQ plus18O'定量技術(shù),為與疾病發(fā)生發(fā)展中相關(guān)的目標糖蛋白研究奠定了良好基礎(chǔ)。 2.系統(tǒng)詳細的對肝病中血清結(jié)合珠蛋白β亞基的聚糖宏觀(糖基化位點占有率)和微觀不均一性(N-聚糖結(jié)構(gòu))進行研究,克服了以往傳統(tǒng)技術(shù)上的一些弱點,對肝病患者的鑒別診斷有一定價值。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R735.7;R575
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