發(fā)布時(shí)間：2020-04-26 13:42

【摘要】：[目的]構(gòu)建mHSF2原核表達(dá)載體,純化mHSF2重組蛋白并研究其在體外是否具有生物活性,能否進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)功能。[方法]以mHSF2為模板,PCR法擴(kuò)增出全長(zhǎng)mHSF2編碼系列,用BamHI和xhoI對(duì)純化產(chǎn)物和pET-28a載體進(jìn)行雙酶切,采用基因重組技術(shù)將mHSF2片段插入至pET-28a原核表達(dá)載體中。測(cè)序正確后,將pET-28a-mHSF2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21中,利用IPTG誘導(dǎo)宿主菌表達(dá)mHSF2,考馬斯亮藍(lán)染色及Western Blot鑒定重組蛋白;用Ni-NTA親和層析法分離重組蛋白,EMSA鑒定純化重組蛋白是否具有生物活性;重組蛋白干預(yù)Raw246.7細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,Western Blot評(píng)估重組蛋白能否進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)功能。[結(jié)果]將鼠全長(zhǎng)HSF2編碼序列克隆到原核表達(dá)載體中,BamHI和xhoI酶切鑒定片段約為1500bp,且pET-28a-mHSF2重組質(zhì)粒測(cè)序正確。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BL21大腸桿菌后在IPTG誘導(dǎo)下可表達(dá)mHSF2。原核表達(dá)重組蛋白能與His抗體及HSF2抗體特異性結(jié)合,鑒定重組蛋白為mHSF2;EMSA檢測(cè)mHSF2與HSE結(jié)合情況,鑒定原核表達(dá)mHSF2具有生物活性;用重組蛋白干預(yù)Raw246.7細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),mHSF2能進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮功能。[結(jié)論]利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了 pET-28a-mHSF2原核表達(dá)載體并表達(dá)可溶性mHSF2;原核表達(dá)所得到的mHSF2具有生物學(xué)功能,并可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),為本課題組后續(xù)研究HSF2奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖１邋ｐＥＴ－２８ａ－ｍＨＳＦ２重組質(zhì)粒模式圖逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｐａｔｔｅｒｎ邋ｏｆ邋ｐＥＴ－２８ａ－ｍＨＳＦ２邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｌａｓｍｉｄ逡逑２、ｍＨＳＦ２ｃＤＮＡ原序列與優(yōu)化序列比對(duì)結(jié)果逡逑將ｐｕｂｍｅｄ上g業(yè)降模恚齲櫻疲蒼蛄杏胗嘔蛄薪行蛄斜榷�，结果可见辶x嫌嘔蛄刑婊渙嗽蛄械模常擔(dān)父黽罨�。辶x希玻村義，

本文編號(hào)：2641559