【摘要】： 目的 肝纖維化是多數(shù)終末期肝病發(fā)展的共同階段,這一階段如果得不到有效治療,將會發(fā)展為肝硬化,甚至導致患者死亡。對于終末期肝病,原位肝移植(Orthotopic liver t ransplantation, OLT)理論上是最理想的治療方法,但是供體的缺乏及術(shù)后免疫排斥反應(yīng)與高額的醫(yī)療費用又成了一個新的問題,即使更新的異位肝移植和原位部分肝移植也存在同樣的問題,因此必須尋找其他可能的解決辦法。干細胞在一定條件下可以分化為肝樣細胞,并補充纖維化過程中損傷的肝細胞,從而在一定程度上逆轉(zhuǎn)和延緩肝纖維化,且不存在免疫排斥,為臨床終末期肝病治療提供了新的思路。 鑒于此,本實驗以體外分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone mesenehymal stem cells, BMSCs)和建立肝硬化動物模型為基礎(chǔ),通過尾靜脈輸注BMSCs來檢測其是否可以改善受損肝臟的肝功能,并探索最佳移植時期,為BMSCs臨床治療肝硬化的可行性提供實驗依據(jù)。 方法 1.體重200-250gSD大鼠60只,設(shè)正常對照組(n=10),普食普水； 2.應(yīng)用40%CCl4油溶液0.3ml／100g皮下注射,以10%酒精為唯一飲用水,誘導大鼠肝硬化模型； 3.取正常健康5周齡大鼠股骨骨髓,貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)MSCs并傳代擴增,獲得足夠量的供移植用MSCs懸液； 4.將培養(yǎng)得到的的健康SD大鼠MSC用DAPI標記,分別于肝硬化造模的第6周,10周經(jīng)尾靜脈注射1×106MSCs; 5.在移植4周后,評價移植組與對照組的生存狀態(tài),觀察肝臟的大體改變及肝臟的重量,行肝功能檢測(ALB.ALT.TBIL.),取肝臟做病理檢查,熒光顯微鏡下觀察,了解BMSCs在肝內(nèi)的整合情況； 6.收集,記錄數(shù)據(jù),做出統(tǒng)計分析。 結(jié)果 1.成功培養(yǎng)出了BMSCs,相差顯微鏡下,新分離的骨髓單個核細胞透亮度好,大小不一,懸浮于培養(yǎng)液中,第3天換液后,可見少量短梭形、星形細胞分散貼壁生長,貼壁后細胞開始分裂增殖,貼壁細胞體積增大,呈現(xiàn)成纖維細胞梭形外觀； 2.皮下注射40%CCl4油溶液8周后,大鼠精神差,進食減少,體重明顯降低(283±19 vs 335±16g),剖腹后可從腹腔抽出5ml左右清亮腹水,肝臟外觀稍腫大(13±1.69 vs 10.02±1.06g),呈不均勻的暗紅色,表面可見大量點狀壞死。生化指標與正常對照組相比：ALT(336.25±6.25 vs 37.67±14.35IU／L,P0.01),ALB(23.13±1.56 vs 33.13±1.51g／L,P0.01),TBIL(16.14±1.28 vs 0.93+0.55μmol／L,P0.01)。 HE染色示：正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失,被假小葉所取代,肝細胞有不同程度的脂肪浸潤、片狀壞死,同時可見炎性細胞浸潤； 3.MSCs經(jīng)尾靜脈移植入肝硬化大鼠后,6周移植組,10移植組大鼠肝功能較對照組均明顯改善,ALT(97±17.35,180±19.68 vs 336.25±6.25IU／L,P0.01),ALB(30.81±1.30,28.8±1.82 vs 23.13±1.56g／L,P0.01),TBIL(13.42±0.82,14.91±1.18 vs16.14±1.28μmol／L,P0.01),P0.05與對照組相比有統(tǒng)計學意義,其中6周移植組較10周移植組效果更佳(F=2.86,P0.05),體重也有所增加(324±17 vs 302±21g)。 病理檢查結(jié)果示：MSCs6周移植組肝內(nèi)膠原纖維增生程度明顯減輕,盡管假小葉仍然存在,但小葉周圍和小葉內(nèi)的膠原纖維明顯減少,10周移植組肝組織部分恢復,但仍然可見損傷細胞、出血和炎性浸潤。 結(jié)論 1.全骨髓貼壁培養(yǎng)法適合大鼠骨髓MSCs的培養(yǎng),具有簡便、經(jīng)濟、細胞獲得率高等特點,且第三代細胞仍有很強的增值能力,達到了移植要求； 2.采用聯(lián)合酒精的四氯化碳復合法,CCl4與豆油混合成40%的濃度,每周皮下注射兩次,在第8周大鼠肝的廣泛區(qū)域觀察到了假小葉,且成模率高,死亡率低,具有簡便、快捷、高效等優(yōu)點,適于制作大批量肝硬化模型； 3.DAPI用來標記、跟蹤細胞的生長、整合情況是可行的； 4.體外傳代培養(yǎng)的骨髓MSCs具有免疫耐受性,同種異體移植后無免疫排斥； 5.MSCs移植能夠改善肝細胞的合成、代謝功能,改善大鼠外周血液的血生化特性和肝的組織學結(jié)構(gòu),且在肝纖維化早期進行移植效果更優(yōu)。
【圖文】：

形、星形細胞分散貼壁生長，伸出偽足呈逗點狀或短棒狀(見圖2)。貼壁后細胞開始分裂增殖，貼壁細胞體積增大，呈現(xiàn)成纖維細胞梭形外觀，有些細胞則呈三角形或多角形，核居中，有1~2個核仁(見圖3)。傳代時幾乎呈均一的成纖維細胞樣細胞，可呈網(wǎng)狀、輻射狀。(見圖4)。各代干細胞詳見附圖。圖1原代粥Cs。(X10O)圖2第一代招Cs。(X100)圖3第二代璐Cs。 (X100)圖4第三代璐Cs。(X100)

貼壁細胞體積增大，呈現(xiàn)成纖維細胞梭形外觀，有些細胞則呈三角形或多角形，核居中，，有1~2個核仁(見圖3)。傳代時幾乎呈均一的成纖維細胞樣細胞，可呈網(wǎng)狀、輻射狀。(見圖4)。各代干細胞詳見附圖。圖1原代粥Cs。(X10O)圖2第一代招Cs。(X100)圖3第二代璐Cs。 (X100)圖4第三代璐Cs。(X100)
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R575.2

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