【摘要】：目的對具有無限或較長期自我更新和多向分化潛能的干細胞及其橫向分化特性的研究為各種疾病提供了新的治療手段。骨髓中含有兩類干細胞,一類是造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSCs),另一類是間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。MSCs源于中胚層,具有很強的自我更新和分化能力,在適當?shù)臈l件下,可以跨胚層“橫向分化”為不同胚層來源的細胞如成骨細胞、神經(jīng)細胞、肝系細胞等。MSCs具有兩大顯著優(yōu)點:一方面其來源廣泛,取材方便,且對身體無害;另一方面MSCs無免疫排斥反應,因而近年來已成為研究熱點。生物醫(yī)學領域對干細胞的研究及其取得的成果,為肝臟疾病的治療提供了新的思路和方法。國內外研究均已證明,MSCs在體內、外均可轉化為肝細胞樣細胞,并具有肝細胞的合成與分泌等功能。為了探索骨髓間充質干細胞橫向分化為肝細胞的作用機制,并研究這些細胞移植到肝內及其在肝內的定向分化。我們將大鼠骨髓間充質干細胞誘導為肝細胞樣細胞后,將其移植到同種大鼠已纖維化的肝臟,觀察其分布、分化情況,并觀察對纖維化的大鼠肝功能改善的效果。方法1.無菌操作,獲得3～4周齡的SD雄性大鼠四肢骨的骨髓細胞,紅細胞裂解液裂解紅細胞后進行貼壁培養(yǎng)以分離、純化MSCs;MSCs傳代4次后,免疫熒光染色法檢測其表面抗原CD44、CD45和CD90的表達情況。HGF+aFGF+OSM誘導骨髓間沖質干細胞向肝細胞分化21天后,倒置相差顯微鏡下觀察其細胞的形態(tài)、大小、細胞核數(shù)目及核漿比的變化;RT-PCR檢測誘導細胞在0、7、14、21天時白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)及細胞角蛋白18(CK18)的表達情況。2.將SD雄性大鼠隨機分為:正常對照組、CCL_4造模組、自發(fā)逆轉組、抗逆轉組。CCL_4造模組采用腹腔注射CCL_4(溶劑為橄欖油,v/v=1:1),劑量按照第一周0.2ml/100g體重,此后0.1 ml/100 g體重,每周2次,持續(xù)8周,于第4周、第6周、第8周處死并留存肝臟和血液標本。正常對照組腹腔注射橄欖油。自發(fā)逆轉組造模方法與劑量同造模組,注射6周后停止,于第8周、第10周處死并留存肝臟和血液標本�？鼓孓D組造模也與造模組相同,注射6周,于第7周起,改為皮下注射CCL_4(橄欖油溶解,v/v=1:1),劑量分別為0.08 ml/100 g體重、0.06 ml/100 g體重、0.04 ml/100 g體重和0.02 ml/100 g體重,每周一次,于第8周、第10周處死后進行肝臟和血液標本的取材。3.肝纖維化的SD大鼠隨機分為移植對照組、肝樣細胞移植組。實驗前6周按造模組方法構建其肝纖維化模型,后4周按抗逆轉0.06組方法維持其肝纖維化狀態(tài)。對照組采用門靜脈輸注生理鹽水,移植組輸入DAPI標記的誘導細胞,細胞移植后分別于第1、2、3、4周處死大鼠,留取肝臟和血清標本。4.肝組織常規(guī)HE染色、Masson三重染色,進行纖維化程度的分期評估和纖維化的半定量統(tǒng)計分析;制作電鏡標本觀察超微結構改變;移植細胞后的SD大鼠肝臟制成冰凍切片,熒光顯微鏡觀察細胞定居;全自動生化分析儀與放射免疫法分別檢測血清肝功能指標(ALT、AST、ALB)和血清肝纖維化指標(HA、LN)。5.統(tǒng)計學分析:計量資料采用單因素方差分析,計數(shù)資料用Ridit分析,以α=0.05為檢驗水準,采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。結果1.顯微鏡下,傳代4次后的間沖質干細胞形態(tài)一致,分布均一,呈梭形或紡錘形,排列具有方向性,呈漩渦狀或平行狀排列。免疫熒光染色結果顯示:CD44與CD90染色陽性,CD45染色陰性。誘導21天時,細胞形態(tài)由異形逐漸變?yōu)轭悎A形、圓形的肝樣細胞,有聚集趨勢。RT-PCR結果提示,細胞于誘導后的第7天,AFP開始表達,第14天ALB及CK18表達。2.造模6周時,肝血竇擴張充血,肝細胞脂肪變性明顯,匯管區(qū)纖維間隔增寬,小血管擴張,部分區(qū)域的肝小葉結構破壞,有假小葉形成趨勢。肝細胞超微結構改變明顯,細胞器數(shù)量減少,部分線粒體嵴髓樣改變,可見腫脹的空泡和脂滴,肝細胞與肝血竇之間可見纖維增生,纖維排列規(guī)則。與正常組相比,纖維化分期和半定量計分有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。肝功能指標ALT、AST,肝纖維化指標HA、LN明顯升高。停藥后肝組織逐漸恢復正常,抗逆轉0.06組肝組織纖維化的各項指標與造模組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。3.體內實驗結果顯示,移植細胞逐漸從血管進入肝臟實質,最終散布于肝細胞間,但移植3周后,熒光衰減明顯。移植組第在2周時,肝組織中的假小葉逐漸吸收或消散,纖維化程度明顯輕于對照組,膠原染色變淺,分布于纖維間隔和匯管區(qū),肝細胞呈氣球樣變性。細胞移植后第4周肝細胞排列接近正常,偶見點狀壞死,無纖維間隔。肝細胞超微結構逐漸恢復正常。細胞移植后第4周,血清肝功能指標ALT、AST、ALB,肝纖維化指標HA、LN與正常組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論1.采用裂解紅細胞與貼壁培養(yǎng)法相結合分離、純化MSCs,可得到活性好和純度高的MSCs。2.在一定的微環(huán)境條件中,HGF+aFGF+OSM能夠誘導大鼠MSCs分化為表達AFP、ALB、CK18的肝細胞。3.腹腔注射50%四氯化碳(每周2次),6周后能夠很好的建立肝纖維化模型,但造模停止后,纖維化自發(fā)逆轉,至停藥4周時,肝組織結構基本恢復正常。4.腹腔注射6周后,改為皮下注射50%四氯化碳(每周1次),能維持造模的纖維化狀態(tài)4周。5.誘導的肝樣細胞植入纖維化的肝組織后,細胞可停留于匯管區(qū)、肝細胞索,植入細胞最早可見于移植后第7天。6.植入誘導的肝樣細胞能夠部分替代肝細胞的功能,延緩疾病的發(fā)展。7.骨髓MSCs誘導的肝樣細胞在肝纖維化形成的肝組織中定向分化為肝細胞可被看作體內誘導。
【學位授予單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R575.2

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本文編號：2640993