發(fā)布時間：2020-04-26 02:43

【摘要】：目的對具有無限或較長期自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞及其橫向分化特性的研究為各種疾病提供了新的治療手段。骨髓中含有兩類干細(xì)胞,一類是造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs),另一類是間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。MSCs源于中胚層,具有很強(qiáng)的自我更新和分化能力,在適當(dāng)?shù)臈l件下,可以跨胚層“橫向分化”為不同胚層來源的細(xì)胞如成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝系細(xì)胞等。MSCs具有兩大顯著優(yōu)點(diǎn):一方面其來源廣泛,取材方便,且對身體無害;另一方面MSCs無免疫排斥反應(yīng),因而近年來已成為研究熱點(diǎn)。生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)Ω杉?xì)胞的研究及其取得的成果,為肝臟疾病的治療提供了新的思路和方法。國內(nèi)外研究均已證明,MSCs在體內(nèi)、外均可轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞,并具有肝細(xì)胞的合成與分泌等功能。為了探索骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞橫向分化為肝細(xì)胞的作用機(jī)制,并研究這些細(xì)胞移植到肝內(nèi)及其在肝內(nèi)的定向分化。我們將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為肝細(xì)胞樣細(xì)胞后,將其移植到同種大鼠已纖維化的肝臟,觀察其分布、分化情況,并觀察對纖維化的大鼠肝功能改善的效果。方法1.無菌操作,獲得3～4周齡的SD雄性大鼠四肢骨的骨髓細(xì)胞,紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后進(jìn)行貼壁培養(yǎng)以分離、純化MSCs;MSCs傳代4次后,免疫熒光染色法檢測其表面抗原CD44、CD45和CD90的表達(dá)情況。HGF+aFGF+OSM誘導(dǎo)骨髓間沖質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化21天后,倒置相差顯微鏡下觀察其細(xì)胞的形態(tài)、大小、細(xì)胞核數(shù)目及核漿比的變化;RT-PCR檢測誘導(dǎo)細(xì)胞在0、7、14、21天時白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)及細(xì)胞角蛋白18(CK18)的表達(dá)情況。2.將SD雄性大鼠隨機(jī)分為:正常對照組、CCL_4造模組、自發(fā)逆轉(zhuǎn)組、抗逆轉(zhuǎn)組。CCL_4造模組采用腹腔注射CCL_4(溶劑為橄欖油,v/v=1:1),劑量按照第一周0.2ml/100g體重,此后0.1 ml/100 g體重,每周2次,持續(xù)8周,于第4周、第6周、第8周處死并留存肝臟和血液標(biāo)本。正常對照組腹腔注射橄欖油。自發(fā)逆轉(zhuǎn)組造模方法與劑量同造模組,注射6周后停止,于第8周、第10周處死并留存肝臟和血液標(biāo)本�？鼓孓D(zhuǎn)組造模也與造模組相同,注射6周,于第7周起,改為皮下注射CCL_4(橄欖油溶解,v/v=1:1),劑量分別為0.08 ml/100 g體重、0.06 ml/100 g體重、0.04 ml/100 g體重和0.02 ml/100 g體重,每周一次,于第8周、第10周處死后進(jìn)行肝臟和血液標(biāo)本的取材。3.肝纖維化的SD大鼠隨機(jī)分為移植對照組、肝樣細(xì)胞移植組。實(shí)驗(yàn)前6周按造模組方法構(gòu)建其肝纖維化模型,后4周按抗逆轉(zhuǎn)0.06組方法維持其肝纖維化狀態(tài)。對照組采用門靜脈輸注生理鹽水,移植組輸入DAPI標(biāo)記的誘導(dǎo)細(xì)胞,細(xì)胞移植后分別于第1、2、3、4周處死大鼠,留取肝臟和血清標(biāo)本。4.肝組織常規(guī)HE染色、Masson三重染色,進(jìn)行纖維化程度的分期評估和纖維化的半定量統(tǒng)計(jì)分析;制作電鏡標(biāo)本觀察超微結(jié)構(gòu)改變;移植細(xì)胞后的SD大鼠肝臟制成冰凍切片,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞定居;全自動生化分析儀與放射免疫法分別檢測血清肝功能指標(biāo)(ALT、AST、ALB)和血清肝纖維化指標(biāo)(HA、LN)。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:計(jì)量資料采用單因素方差分析,計(jì)數(shù)資料用Ridit分析,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn),采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果1.顯微鏡下,傳代4次后的間沖質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)一致,分布均一,呈梭形或紡錘形,排列具有方向性,呈漩渦狀或平行狀排列。免疫熒光染色結(jié)果顯示:CD44與CD90染色陽性,CD45染色陰性。誘導(dǎo)21天時,細(xì)胞形態(tài)由異形逐漸變?yōu)轭悎A形、圓形的肝樣細(xì)胞,有聚集趨勢。RT-PCR結(jié)果提示,細(xì)胞于誘導(dǎo)后的第7天,AFP開始表達(dá),第14天ALB及CK18表達(dá)。2.造模6周時,肝血竇擴(kuò)張充血,肝細(xì)胞脂肪變性明顯,匯管區(qū)纖維間隔增寬,小血管擴(kuò)張,部分區(qū)域的肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,有假小葉形成趨勢。肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變明顯,細(xì)胞器數(shù)量減少,部分線粒體嵴髓樣改變,可見腫脹的空泡和脂滴,肝細(xì)胞與肝血竇之間可見纖維增生,纖維排列規(guī)則。與正常組相比,纖維化分期和半定量計(jì)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。肝功能指標(biāo)ALT、AST,肝纖維化指標(biāo)HA、LN明顯升高。停藥后肝組織逐漸恢復(fù)正常,抗逆轉(zhuǎn)0.06組肝組織纖維化的各項(xiàng)指標(biāo)與造模組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,移植細(xì)胞逐漸從血管進(jìn)入肝臟實(shí)質(zhì),最終散布于肝細(xì)胞間,但移植3周后,熒光衰減明顯。移植組第在2周時,肝組織中的假小葉逐漸吸收或消散,纖維化程度明顯輕于對照組,膠原染色變淺,分布于纖維間隔和匯管區(qū),肝細(xì)胞呈氣球樣變性。細(xì)胞移植后第4周肝細(xì)胞排列接近正常,偶見點(diǎn)狀壞死,無纖維間隔。肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)正常。細(xì)胞移植后第4周,血清肝功能指標(biāo)ALT、AST、ALB,肝纖維化指標(biāo)HA、LN與正常組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論1.采用裂解紅細(xì)胞與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合分離、純化MSCs,可得到活性好和純度高的MSCs。2.在一定的微環(huán)境條件中,HGF+aFGF+OSM能夠誘導(dǎo)大鼠MSCs分化為表達(dá)AFP、ALB、CK18的肝細(xì)胞。3.腹腔注射50%四氯化碳(每周2次),6周后能夠很好的建立肝纖維化模型,但造模停止后,纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn),至停藥4周時,肝組織結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。4.腹腔注射6周后,改為皮下注射50%四氯化碳(每周1次),能維持造模的纖維化狀態(tài)4周。5.誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞植入纖維化的肝組織后,細(xì)胞可停留于匯管區(qū)、肝細(xì)胞索,植入細(xì)胞最早可見于移植后第7天。6.植入誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞能夠部分替代肝細(xì)胞的功能,延緩疾病的發(fā)展。7.骨髓MSCs誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞在肝纖維化形成的肝組織中定向分化為肝細(xì)胞可被看作體內(nèi)誘導(dǎo)。
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R575.2

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本文編號：2640993