【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染引起的慢性乙型肝炎是嚴重危害人類健康的疾病。全球約有3.5億慢性乙型肝炎患者,慢性乙型肝炎患者會進一步發(fā)展成為肝硬化和肝癌。 目前,對于乙型肝炎病毒感染慢性化的機制尚不清楚,一般認為由病毒復制損害免疫系統(tǒng)功能與機體免疫應答不足兩個因素復雜作用造成的。天然免疫系統(tǒng)作為抵抗病毒的第一道防線,其功能受損,往往會造成后續(xù)適應性免疫應答缺損,造成持續(xù)性感染。巨噬細胞是天然免疫中非常重要的組成部分,是專職的抗原遞呈細胞,在啟動病毒特異性的T細胞免疫應答中扮演了關鍵的角色。已有文獻報道HBV能夠抑制巨噬細胞的功能,但是具體機制尚不清楚。乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)在患者肝臟和血液中大量存在,推測其可能在HBV感染慢性化過程中扮演了重要的角色。 本課題前期研究發(fā)現(xiàn),慢性乙肝患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)表達的TLR4水平以及TLR4介導的細胞因子分泌水平低于正常對照,且與血清HBsAg的量直接相關,據(jù)此推測HBsAg抑制了TLR4信號轉(zhuǎn)導通路。鑒于TLR4主要在單核巨噬細胞中表達,因此,本課題以PMA分化的THP-1和小鼠腹腔巨噬細胞作為研究對象,研究HBsAg對巨噬細胞TLR4信號通路的影響,并從HBsAg能否被巨噬細胞吞噬,HBsAg對巨噬細胞表面TLR4表達的影響,TLR4下游信號通路的活化以及細胞因子的產(chǎn)生四個方面深入研究其中的分子機制。 首先,用HBsAg處理PMA分化的THP-1細胞,流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)細胞表面TLR4分子的表達水平下調(diào)。為證實HBsAg對TLR4下游信號轉(zhuǎn)導產(chǎn)生的影響,用不同劑量HBsAg處理PMA分化的THP-1細胞并用LPS激活TLR4信號通路。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),HBsAg能夠以劑量依賴的方式抑制TLR4下游JNK和p38信號通路的磷酸化,但是對ERK信號通路卻沒有顯著影響。進一步研究HBsAg對JNK/p38信號通路磷酸酶MKP-1(負向調(diào)控因子)和JNK上游激酶MKK4(正向調(diào)控因子)的影響。結(jié)果顯示,HBsAg并不影響MKP-1的表達水平,但是抑制MKK4的磷酸化。上述結(jié)果提示,HBsAg可抑制單核巨噬細胞TLR4分子的表達及TLR4信號通路的活化,其對信號通路作用的關鍵位點在TLR4信號通路的上游部位。 為了驗證HBsAg如何作用于PMA分化的THP-1細胞,通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達HBsAg的THP-1細胞系。穩(wěn)定表達HBsAg的THP-1巨噬細胞中,JNK和p38信號通路的磷酸化也受到抑制,并且TLR4配體LPS誘導細胞產(chǎn)生的細胞因子減少。同時用表達HBsAg的轉(zhuǎn)基因小鼠,分離小鼠腹腔巨噬細胞,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔巨噬細胞分泌細胞因子IL-12的能力以及JNK信號通路的活化能力較野生型小鼠低。上述結(jié)果進一步證實HBsAg能夠抑制巨噬細胞TLR4信號通路的活化。 為進一步分析HBsAg抑制TLR4分子表達和信號通路活化的分子機制,對HBsAg的內(nèi)吞與信號通路抑制間的因果關系進行了驗證。用Alexa Flour488標記自病人血清中純化的HBsAg,共聚焦顯微鏡和流式細胞術證實HBsAg能被PMA分化的THP-1巨噬細胞所吞噬,并定位于巨噬細胞溶酶體中。用內(nèi)體酸化抑制劑Bafilomycin A1抑制溶酶體成熟后,HBsAg進入細胞的比例顯著減少,并能部分回復HBsAg對JNK信號通路的抑制作用,提示HBsAg對巨噬細胞TLR4信號通路的抑制作用可能與其被吞噬有關。 由于HBsAg能被巨噬細胞吞噬,并且有文獻報道定位于晚期內(nèi)體溶酶體中的Rab7b分子能負調(diào)TLR4分子的表達,因此推鋇HBsAg內(nèi)吞、Rab7b分子表達與TLR4表達下降這三者間存在一定的關系。進一步的實驗結(jié)果顯示,HBsAg預處理PMA分化后的THP-1細胞后,能夠上調(diào)定位在晚期內(nèi)體的Rab7b mRNA水平,但是不影響定位在早期內(nèi)體的Rab5的RNA水平,提示HBsAg通過內(nèi)吞入胞而上調(diào)Rab7b表達,這可能是HBsAg抑制TLR4表達并進一步抑制TLR4信號通路的機制之一。 綜上所述,本研究表明乙型肝炎病毒表面抗原可以抑制巨噬細胞TLR4下游JNK/p38信號通路的磷酸化以及細胞因子IL-12的產(chǎn)生,這種抑制作用可能與HBsAg被內(nèi)吞后上調(diào)定位在晚期內(nèi)體溶酶體的Rab7b分子相關。本研究結(jié)果部分闡述了乙型肝炎病毒感染慢性化的機制,即乙型肝炎病毒利用HBsAg削弱天然免疫系統(tǒng)中抗原遞呈細胞的功能,而建立慢性持續(xù)性感染,為探索慢性乙型肝炎治療的新方法提供了新的理論基礎和實驗依據(jù)。
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去多余染液，置37°C溫箱內(nèi)30分鐘至1小時，使樣品干燥。銅網(wǎng)可立即在電鏡下觀察。電鏡下觀察時放大40，000倍左右，圖1A所示，在突光屏上可見圓形白色顆粒為乙肝病毒表面抗原，a惡姿崛舊塵拔諫圖1A血源性HBsAg的電鏡圖配置12%聚丙烯酷胺凝膠，取5^11、10^1 HBsAg (Img/ml)與等體積2xSDSLoading混勻后，沸水煮10分鐘，，冷卻后上12%的SDS-PAGE膠，2孔，各lOpl

5%脫脂牛奶封閉后加一抗4度過夜，第二天洗膜后二抗孵育2小時后洗膜。發(fā)光如圖IB所示，無論Western blot (左）或是銀染（右），顯示均有3條帶，自下而上分別是S蛋白的p24、糖基化的gp27和S蛋白的二聚體。26
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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1 ;The Roles of Innate Immune Cells in Liver Injury and Regeneration[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年04期

本文編號：2640923