【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染引起的慢性乙型肝炎是嚴(yán)重危害人類健康的疾病。全球約有3.5億慢性乙型肝炎患者,慢性乙型肝炎患者會進(jìn)一步發(fā)展成為肝硬化和肝癌。 目前,對于乙型肝炎病毒感染慢性化的機(jī)制尚不清楚,一般認(rèn)為由病毒復(fù)制損害免疫系統(tǒng)功能與機(jī)體免疫應(yīng)答不足兩個(gè)因素復(fù)雜作用造成的。天然免疫系統(tǒng)作為抵抗病毒的第一道防線,其功能受損,往往會造成后續(xù)適應(yīng)性免疫應(yīng)答缺損,造成持續(xù)性感染。巨噬細(xì)胞是天然免疫中非常重要的組成部分,是專職的抗原遞呈細(xì)胞,在啟動病毒特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答中扮演了關(guān)鍵的角色。已有文獻(xiàn)報(bào)道HBV能夠抑制巨噬細(xì)胞的功能,但是具體機(jī)制尚不清楚。乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)在患者肝臟和血液中大量存在,推測其可能在HBV感染慢性化過程中扮演了重要的角色。 本課題前期研究發(fā)現(xiàn),慢性乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)表達(dá)的TLR4水平以及TLR4介導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌水平低于正常對照,且與血清HBsAg的量直接相關(guān),據(jù)此推測HBsAg抑制了TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。鑒于TLR4主要在單核巨噬細(xì)胞中表達(dá),因此,本課題以PMA分化的THP-1和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為研究對象,研究HBsAg對巨噬細(xì)胞TLR4信號通路的影響,并從HBsAg能否被巨噬細(xì)胞吞噬,HBsAg對巨噬細(xì)胞表面TLR4表達(dá)的影響,TLR4下游信號通路的活化以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生四個(gè)方面深入研究其中的分子機(jī)制。 首先,用HBsAg處理PMA分化的THP-1細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面TLR4分子的表達(dá)水平下調(diào)。為證實(shí)HBsAg對TLR4下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生的影響,用不同劑量HBsAg處理PMA分化的THP-1細(xì)胞并用LPS激活TLR4信號通路。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),HBsAg能夠以劑量依賴的方式抑制TLR4下游JNK和p38信號通路的磷酸化,但是對ERK信號通路卻沒有顯著影響。進(jìn)一步研究HBsAg對JNK/p38信號通路磷酸酶MKP-1(負(fù)向調(diào)控因子)和JNK上游激酶MKK4(正向調(diào)控因子)的影響。結(jié)果顯示,HBsAg并不影響MKP-1的表達(dá)水平,但是抑制MKK4的磷酸化。上述結(jié)果提示,HBsAg可抑制單核巨噬細(xì)胞TLR4分子的表達(dá)及TLR4信號通路的活化,其對信號通路作用的關(guān)鍵位點(diǎn)在TLR4信號通路的上游部位。 為了驗(yàn)證HBsAg如何作用于PMA分化的THP-1細(xì)胞,通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)HBsAg的THP-1細(xì)胞系。穩(wěn)定表達(dá)HBsAg的THP-1巨噬細(xì)胞中,JNK和p38信號通路的磷酸化也受到抑制,并且TLR4配體LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子減少。同時(shí)用表達(dá)HBsAg的轉(zhuǎn)基因小鼠,分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-12的能力以及JNK信號通路的活化能力較野生型小鼠低。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)HBsAg能夠抑制巨噬細(xì)胞TLR4信號通路的活化。 為進(jìn)一步分析HBsAg抑制TLR4分子表達(dá)和信號通路活化的分子機(jī)制,對HBsAg的內(nèi)吞與信號通路抑制間的因果關(guān)系進(jìn)行了驗(yàn)證。用Alexa Flour488標(biāo)記自病人血清中純化的HBsAg,共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)HBsAg能被PMA分化的THP-1巨噬細(xì)胞所吞噬,并定位于巨噬細(xì)胞溶酶體中。用內(nèi)體酸化抑制劑Bafilomycin A1抑制溶酶體成熟后,HBsAg進(jìn)入細(xì)胞的比例顯著減少,并能部分回復(fù)HBsAg對JNK信號通路的抑制作用,提示HBsAg對巨噬細(xì)胞TLR4信號通路的抑制作用可能與其被吞噬有關(guān)。 由于HBsAg能被巨噬細(xì)胞吞噬,并且有文獻(xiàn)報(bào)道定位于晚期內(nèi)體溶酶體中的Rab7b分子能負(fù)調(diào)TLR4分子的表達(dá),因此推鋇HBsAg內(nèi)吞、Rab7b分子表達(dá)與TLR4表達(dá)下降這三者間存在一定的關(guān)系。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HBsAg預(yù)處理PMA分化后的THP-1細(xì)胞后,能夠上調(diào)定位在晚期內(nèi)體的Rab7b mRNA水平,但是不影響定位在早期內(nèi)體的Rab5的RNA水平,提示HBsAg通過內(nèi)吞入胞而上調(diào)Rab7b表達(dá),這可能是HBsAg抑制TLR4表達(dá)并進(jìn)一步抑制TLR4信號通路的機(jī)制之一。 綜上所述,本研究表明乙型肝炎病毒表面抗原可以抑制巨噬細(xì)胞TLR4下游JNK/p38信號通路的磷酸化以及細(xì)胞因子IL-12的產(chǎn)生,這種抑制作用可能與HBsAg被內(nèi)吞后上調(diào)定位在晚期內(nèi)體溶酶體的Rab7b分子相關(guān)。本研究結(jié)果部分闡述了乙型肝炎病毒感染慢性化的機(jī)制,即乙型肝炎病毒利用HBsAg削弱天然免疫系統(tǒng)中抗原遞呈細(xì)胞的功能,而建立慢性持續(xù)性感染,為探索慢性乙型肝炎治療的新方法提供了新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

去多余染液，置37°C溫箱內(nèi)30分鐘至1小時(shí)，使樣品干燥。銅網(wǎng)可立即在電鏡下觀察。電鏡下觀察時(shí)放大40，000倍左右，圖1A所示，在突光屏上可見圓形白色顆粒為乙肝病毒表面抗原，a惡姿崛舊塵拔諫圖1A血源性HBsAg的電鏡圖配置12%聚丙烯酷胺凝膠，取5^11、10^1 HBsAg (Img/ml)與等體積2xSDSLoading混勻后，沸水煮10分鐘，，冷卻后上12%的SDS-PAGE膠，2孔，各lOpl

5%脫脂牛奶封閉后加一抗4度過夜，第二天洗膜后二抗孵育2小時(shí)后洗膜。發(fā)光如圖IB所示，無論Western blot (左）或是銀染（右），顯示均有3條帶，自下而上分別是S蛋白的p24、糖基化的gp27和S蛋白的二聚體。26
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;The Roles of Innate Immune Cells in Liver Injury and Regeneration[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年04期

本文編號：2640923