【摘要】：HCV是一種正單鏈RNA病毒,能夠通過(guò)感染宿主細(xì)胞,引發(fā)機(jī)體病毒性肝炎、肝纖維化乃至肝癌的發(fā)生。HCV的感染往往伴隨機(jī)體因天然免疫而引發(fā)的慢性炎癥反應(yīng),此過(guò)程有眾多模式識(shí)別受體的參與。 Toll樣受體是一類(lèi)通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式,介導(dǎo)機(jī)體天然免疫,并能作為橋梁連接機(jī)體天然免疫與獲得性免疫的一類(lèi)重要模式識(shí)別受體。Toll樣受體能夠識(shí)別多種病原微生物的固有成分,介導(dǎo)機(jī)體針對(duì)多種病原菌與病毒的免疫反應(yīng)。 TLR7存在于細(xì)胞內(nèi)體表面,通過(guò)識(shí)別包括I型HIV、手足口病及A型流感病毒在內(nèi)的多種單鏈RNA病毒,介導(dǎo)機(jī)體抗病毒免疫。TLR7被其配體激活后,通過(guò)下游接頭蛋白分子MyD88將激活信號(hào)向下游傳遞,最終激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,進(jìn)而產(chǎn)生多種促炎因子與I型干擾素,引起機(jī)體炎癥反應(yīng)。TLR7屬于I型跨膜蛋白,由胞外區(qū)、跨膜區(qū)與胞內(nèi)區(qū)組成。其胞外區(qū)由多個(gè)富含亮氨酸的LRR區(qū)組成,主要參與TLR7與其配體的識(shí)別,跨膜區(qū)主要負(fù)責(zé)TLR7分子的錨定,而胞內(nèi)區(qū)則負(fù)責(zé)TLR7激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。目前雖然研究發(fā)現(xiàn)多種單鏈RNA病毒感染所激活的天然免疫反應(yīng)均有TLR7分子參與,但在HCV感染機(jī)體所引起的天然免疫應(yīng)答過(guò)程中,TLR7的所起的作用尚不明確。此外,雖然TLR7分子通過(guò)其胞內(nèi)區(qū)將激活信號(hào)向下傳遞,但TLR7分子胞內(nèi)區(qū)介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體機(jī)制還不清楚。 根據(jù)以上研究背景,本研究從HCV感染所激活機(jī)體天然免疫反應(yīng)入手,闡明TLR7在HCV感染過(guò)程中的作用,并進(jìn)一步從蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)影響功能的角度,解釋了TLR7被激活后通過(guò)胞內(nèi)區(qū)進(jìn)行信號(hào)傳遞的具體機(jī)制。因此本研究主要從HCV感染過(guò)程中TLR7分子的作用與TLR7分子胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)對(duì)信號(hào)傳遞的影響兩個(gè)方面,分為如下兩個(gè)部分進(jìn)行: 1. HCV感染過(guò)程中TLR7分子的作用 本研究首先利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCV基因組的Huh7細(xì)胞所表達(dá)的HCV全基因組RNA刺激外周血單核細(xì)胞(PBMCs),通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)量,我們發(fā)現(xiàn)HCV基因組RNA能夠刺激PBMCs顯著上調(diào)TNF-α與IFN-α。因此證實(shí)HCV可以通過(guò)其單鏈RNA基因組激活機(jī)體天然免疫反應(yīng)。由于TLR7天然狀態(tài)下的配體為單鏈RNA病毒,因此該激活很可能通過(guò)TLR7介導(dǎo)。 由于在細(xì)胞內(nèi)體中病毒基因組將被降解成許多大小不等的寡聚核苷酸片段(ORNs),因此我們根據(jù)TLR7識(shí)別序列特點(diǎn),以HCV基因組為模板人工合成多條ORNs,并用這些ORNs刺激新分離的PBMCs細(xì)胞,通過(guò)ELISA檢測(cè)我們證實(shí)位于1000位的ORN1000與位于HCV 3’端尾部的ORNHCVtail能夠刺激PBMCs上調(diào)TNF-α與IFN-α的表達(dá)。 TLR7被配體激活后將活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與IRF7,從而啟動(dòng)基因的表達(dá)。因此,我們利用人工合成的ORNs刺激Huh7細(xì)胞,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)ORN1000與ORNHCVtail可以激活NF-κB與IRF7。 為了確定TLR7是否真的參與HCV感染過(guò)程所引起的免疫激活,我們通過(guò)RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)當(dāng)TLR7被干擾時(shí), ORNs刺激細(xì)胞所造成NF-κB的激活強(qiáng)度明顯下降。而通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使TLR7過(guò)表達(dá)后,NF-κB的激活強(qiáng)度顯著提高。因此,我們確定HCV基因組片段對(duì)于機(jī)體天然免疫反應(yīng)的激活能夠通過(guò)TLR7進(jìn)行的。 2. TLR7分子結(jié)構(gòu)對(duì)信號(hào)傳遞的影響 TLR7分子被激活后能夠通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活基因表達(dá)。雖然TLR7通過(guò)胞內(nèi)區(qū)募集接頭蛋白MyD88從而激活信號(hào)通路已比較清楚,然而該分子具體通過(guò)胞內(nèi)區(qū)哪些位點(diǎn)介導(dǎo)對(duì)MyD88的募集卻尚無(wú)定論。因此我們對(duì)TLR7胞內(nèi)區(qū)蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,以期篩選出對(duì)TLR7信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起關(guān)鍵作用位點(diǎn),并解釋其產(chǎn)生作用的機(jī)制。首先,我們分析了TLR7胞內(nèi)區(qū)的序列特征,并且構(gòu)建了胞內(nèi)區(qū)全長(zhǎng)與半長(zhǎng)缺失體的真核表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)對(duì)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)NF-κB的激活情況,我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染TLR7胞內(nèi)區(qū)全長(zhǎng)與半長(zhǎng)缺失體的實(shí)驗(yàn)組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的陰性對(duì)照組之間均無(wú)差別,因此我們將TLR7胞內(nèi)區(qū)的關(guān)鍵位點(diǎn)鎖定在胞內(nèi)區(qū)的后半段。接著,我們?cè)诎麅?nèi)區(qū)后半段以大約20個(gè)氨基酸為間隔構(gòu)建了一系列的缺失質(zhì)粒。通過(guò)檢測(cè)NF-κB激活情況,我們將關(guān)鍵位點(diǎn)鎖定在一個(gè)含有16個(gè)氨基酸的區(qū)域。然后,我們通過(guò)一系列位點(diǎn)特異性點(diǎn)突變的方法,證明這16個(gè)氨基酸中存在2個(gè)分別位于1004位與1006位的精氨酸能夠?qū)LR7功能產(chǎn)生影響。最后我們通過(guò)免疫共沉淀的方法證明,這2個(gè)精氨酸中只有1004位的精氨酸是通過(guò)影響TLR7與下游接頭蛋白MyD88的結(jié)合來(lái)影響TLR7信號(hào)傳遞的。 總之,本研究首先證實(shí)了HCV感染所引起的天然免疫反應(yīng)由TLR7分子介導(dǎo),TLR7分子激活信號(hào)的缺失將導(dǎo)致機(jī)體抗HCV感染免疫應(yīng)答水平顯著下降。而進(jìn)一步對(duì)TLR7分子結(jié)構(gòu)功能分析發(fā)現(xiàn),TLR7胞內(nèi)區(qū)位于1004位的精氨酸能夠通過(guò)影響TLR7與下游接頭蛋白MyD88結(jié)合的方式影響TLR7激活信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。該發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步闡明了TLR7信號(hào)傳遞機(jī)制的分子基礎(chǔ),并為基于TLR7的臨床診斷與治療提供新的靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖 1 HCV 基因組 RNA 激活天然免疫應(yīng)答Figure1. Cytokine production by human PBMCs in response to HCV genomic RNAA and B) PBMCs were isolated and stimulated with HCV genomic RNA. IFN-α aNF-α were determined by ELISA after stimulation for 18 h. (C and D) PBMCs wesolated and plated in a 96-well plate. Increasing doses of HCV genomic RNA (from 0.o 0.5 μg/ml) were used to stimulate PBMCs, and IFN-α and TNF-α were determined LISA after stimulation for 18 h. Values represent mean value ± standard deviations hree independent experiments.（二）HCV 源寡聚核苷酸激活天然免疫天然狀態(tài)下許多病毒入侵機(jī)體后將被細(xì)胞吞噬入內(nèi)體，并在內(nèi)體完成脫衣殼等。在內(nèi)體內(nèi)，許多病毒的基因組將被降解成寡聚核苷酸，而其中某些寡聚核苷酸(ORNs)能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。研究證明，pDC 對(duì) HIV 病毒基因組中一段為 RNA40 的富含尿嘧啶的區(qū)域高度敏感，，以該區(qū)域序列為基礎(chǔ)合成的 ORN 可[9]

圖 2 HCV-ORN 激活天然免疫應(yīng)答Figure2. Cytokine production by human PBMCs in response to HCV-ORNs and B) PBMCs were isolated and stimulated with HCV genomic RNA. IFN-αF-α were determined by ELISA after stimulation for 18 h. Values represent mean vstandard deviations of three independent experiments.三）HCV 源寡聚核苷酸激活 TLR7 信號(hào)通路HCV 感染是誘發(fā)肝細(xì)胞發(fā)生纖維化乃至癌變的重要因素，而 TLR7 信號(hào)通能在機(jī)體抵御 HCV 感染免疫過(guò)程中起重要作用。因此我們首先在肝癌細(xì)胞 He Huh7 內(nèi)檢測(cè) TLR7 分子的表達(dá)情況。通過(guò) Realtime PCR 與 Western blotting 檢們發(fā)現(xiàn) TLR7 分子在 Huh7 細(xì)胞中有表達(dá)（圖 3A）。TLR7 被配體激活后經(jīng)過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終激活轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 與 IRF動(dòng)炎癥細(xì)胞因子與 I 型干擾素基因的表達(dá)[18]。因此，為了驗(yàn)證根據(jù) HCV 基因人工合成的 ORNs 是否通過(guò)激活 TLR7 信號(hào)通路引起天然免疫應(yīng)答，我們?cè)?H
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R512.63

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本文編號(hào)：2640796