發(fā)布時間：2020-04-25 20:49

【摘要】： 目的探討多藥耐藥基因(MDR1)多態(tài)性(C3435T和G2677T/A)與我國炎癥性腸病的臨床關(guān)聯(lián)。 方法收集臨床確診的71例IBD患者(60例UC,11例CD)外周抗凝血,提取DNA,采用多聚酶鏈式反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性方法測定MDR1的多態(tài)性。同時記錄IBD患者的病史和相關(guān)檢查結(jié)果,記錄UC患者使用激素的治療反應(yīng),用于分組比較。對照組為性別匹配、年齡基本匹配的無消化道癥狀的健康體檢者。調(diào)取60例確診UC患者結(jié)腸鏡檢查的粘膜活檢病理蠟塊,同時留取門診結(jié)腸鏡檢查正常的健康對照者的結(jié)腸粘膜,共20例。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶(SP)法,了解結(jié)腸粘膜Pgp的表達變化。 結(jié)果⑴UC患者臨床資料分析:60例UC患者男性多于女性,男女性別比例1.3:1,平均發(fā)病年齡38.7±13.0歲,20~40歲為發(fā)病高峰,平均病程3.7±4.3年。其中伴腸外表現(xiàn)者:膽結(jié)石4例(6.6%),口腔潰瘍5例(8.3%),壞疽性膿皮病1例(1.6%)。使用口服激素或靜脈激素治療共30例(50%),其中激素耐藥或依賴5例(16.6%),使用免疫抑制劑硫唑嘌呤治療2例(6.7%)。臨床類型以慢性復發(fā)型(41例,68.3%)和初發(fā)型(13例,21.7%)為主,慢性持續(xù)型5例(8.3%),暴發(fā)型1例(1.7%)。病變范圍以全結(jié)腸型為主(25例,41.6%),直腸/直乙狀結(jié)腸型21例(35%),廣泛結(jié)腸型7例(11.7%),左半結(jié)腸型7例(11.7%)�；顒悠赨C中全結(jié)腸炎患者及廣泛結(jié)腸炎患者病變嚴重度以重度為主,而左半結(jié)腸炎患者及直腸/直乙狀結(jié)腸炎患者病變嚴重度以輕度為主。病變范圍與臨床類型無關(guān)。⑵CD患者臨床資料分析:11例CD患者平均發(fā)病年齡36.3±12.4歲,平均病程2.6±1.9年,男女性別比1.2:1。病變類型以非狹窄、非穿孔型(5例,45.5%)和狹窄型(5例,45.5%)為主,穿孔型1例(9.0%),伴肛周病變2例(18.2%)。病變部位以回腸型及回結(jié)腸型居多(分別為27.2%和36.4%)。行左半結(jié)腸切除術(shù)1例(9.1%)。使用激素治療共6例(54.5%),其中強的松聯(lián)合免疫抑制劑硫唑嘌呤治療共4例(36.4%)。⑶MDR1基因型分析:病例組和對照組中MDR1 C3435T和G2677T/A基因分布符合Hardy-Weinberg平衡(P0.05)。病例組中MDR1 C3435T基因型頻率分別為CC型38.0%,CT型45.1%,TT型16.9%;MDR1 G2677/A基因型頻率分別為GG型33.8%,GA型25.4%,GT型11.2%,TT型15.5%,TA型9.9%,AA型4.2%。MDR1 C3435T和G2677T/A各基因型在病例組和對照組中總體分布沒有差別。C3435T TT基因型頻率和T等位基因頻率在IBD組和對照組中分布無顯著差異,比較G2677T/A TT型基因頻率和T等位基因頻率在兩組中的分布,也未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異。C3435T各基因型與UC病變范圍及病變嚴重度均無關(guān)。G2677T/A TT基因型在直腸/直乙狀結(jié)腸炎中占有明顯優(yōu)勢(P=0.048,OR 3.375(1.01~11.279)),但與UC病變嚴重度無關(guān)。觀察記錄全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療的UC患者,按糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng),分為激素有效組和激素依賴或耐藥組。比較發(fā)現(xiàn)激素有效組與對照組相比MDR1基因型分布無統(tǒng)計學差異。C3435T TT基因型頻率和T等位基因頻率以及G2677T/A TT基因型頻率和T等位基因頻率在上述各組分布均無差異。⑷Pgp免疫組化結(jié)果:在UC病例組Pgp表達陽性率65%(39例),對照組Pgp表達陽性率55%(11例),兩組Pgp陽性率無顯著差異(χ2=0.640,P=0.424)。其中病例資料完整共37例,按照UC病變嚴重程度分組后比較,發(fā)現(xiàn)在UC輕度活動組Pgp表達陽性率最高(80%),但是與對照組及UC中度組、重度組相比,無統(tǒng)計學差別(P0.05)。 結(jié)論(1)UC以青壯年發(fā)病居多,住院病例中累及全結(jié)腸多見。臨床類型以慢性復發(fā)型為主�；顒悠赨C中,病變范圍與病變嚴重度有關(guān)。CD病變以非狹窄非穿孔型及狹窄型為主,病變部位以回腸及回結(jié)腸居多。(2)MDR1基因多態(tài)性在IBD組與對照組之間分布無差異。各基因型與UC病變嚴重度無關(guān),但可能會影響UC病變范圍,G2677T/A TT基因型與直腸/直乙狀結(jié)腸炎明顯相關(guān)。(3)未發(fā)現(xiàn)MDR1基因多態(tài)性與UC激素療效相關(guān),但由于樣本量較少,進一步大樣本研究仍有必要。(4)UC結(jié)腸粘膜Pgp表達與正常人相比無顯著差異,UC病變嚴重度與Pgp表達無明顯相關(guān)。
【圖文】：

MDR1 基因多態(tài)性。PCR 反應(yīng)體積 20ul，含 10×buffer 2ul，1.5mmol/L MgC0.2mmol/L dNTP，10mmol/L 引物，2U Taq DNA 聚合酶，8.2ul 雙蒸水。2.2.3.3.1C3435T 基因型測定C3435T 引物，正向：5’-TGC TGG TCC TGA AGT TGA TCT GTG AAC-3’；反5’-ACA TTA GGC AGT GAC TCG ATG AAG GCA-3’[15,26]。PCR 反應(yīng)條件：9變性 5min，再變性 1min，58°退火 1min，72°延伸 1min，共 35 個循環(huán)，72°再5min。PCR 產(chǎn)物用 MboI 酶切，反應(yīng)體積 20ul，含 10×NEB 緩沖液 2uL，PC物 5uL，MboI 0.5uL，雙蒸水 12.5uL。37°水浴 2h。2%溴乙錠瓊脂糖凝膠電泳泳條件 100V，電泳 1h。凝膠成像系統(tǒng)攝片觀察結(jié)果。PCR 擴增產(chǎn)物 238bp。經(jīng) MboI 酶切后 2%瓊脂糖電泳分析顯示：TT 型（238CT 型（238bp、172bp、60bp），CC 型（172bp、60bp）。由于 60bp 片段較小泳后條只顯示 238bp、172bp。如圖 1。

退火溫度 56.5°，其余條件同 C3435T。PCR 產(chǎn)物經(jīng) BanI （NEB 公司）37切 2h，反應(yīng)體積 20uL，，含 10×NEB 緩沖液 2uL，PCR 產(chǎn)物 5uL，MboI 0.5蒸水 12.5uL。G2677T 退火溫度 53°，PCR 產(chǎn)物經(jīng) BsrI（NEB 公司） 65°水2h，反應(yīng)體積同上。酶切產(chǎn)物經(jīng) 2%溴乙錠瓊脂糖凝膠電泳，100V，電泳膠成像系統(tǒng)攝片觀察結(jié)果。G2677T PCR 產(chǎn)物 224bp。經(jīng) BanI 酶切電泳顯示（如圖 2）：（1）兩條帶（26bp）：GG 型；（2）一條帶（224bp）：基因型可能是 TT 型、TA 型、AA 三條帶（224bp、198bp、26bp）：基因型可能是 GT 型、GA 型。后兩者需G2677A 引物再次行 PCR， PCR 產(chǎn)物 220bp。經(jīng) BsrI 酶切，能將帶有 A 等的 DNA 切開，故對于前者第二種情況的，酶切后分型如下：TT 型（220b型（220bp、206bp、14bp），AA 型（206bp、14bp）。對前述第三種情況的后分型如下：GT 型（220bp），GA 型（220bp、206bp、14bp）。由于 14b片段太小，電泳后只能顯示出 224bp、198bp、220bp、206bp。如圖 3 所示
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R574.62

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 胡靜;梅俏;胡乃中;許建明;;克羅恩病臨床生物學行為及其治療方法研究[J];安徽醫(yī)學;2011年09期

2 施麗婕;楊強;垢敬;陳大權(quán);王靜;周正華;;化瘀通陽灌腸方對潰瘍性結(jié)腸炎患者高凝狀態(tài)的影響[J];中華中醫(yī)藥雜志;2012年08期

3 沈Y

本文編號：2640673