發(fā)布時(shí)間：2020-04-25 07:25

【摘要】：研究背景肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)被認(rèn)為是參與肝纖維化最關(guān)鍵的細(xì)胞。局部組織的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-Angiotensin-System,RAS)與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,已證實(shí)Ang-(1-7)有拮抗AngⅡ誘導(dǎo)的肝纖維化作用。新發(fā)現(xiàn)RAS的組分alamandine,其結(jié)構(gòu)與Ang-(1-7)相似,可通過(guò)受體MrgD對(duì)AngⅡ發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。自噬(autophagy)為HSC活化供能,促進(jìn)HSC向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化并分泌細(xì)胞外基質(zhì);活性氧(ROS)作為氧化應(yīng)激(oxidative stress)的主要產(chǎn)物,是目前公認(rèn)的自噬誘導(dǎo)劑之一。因此,alamandine是否能通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激和自噬,進(jìn)而對(duì)肝纖維化產(chǎn)生影響,是本文研究的重點(diǎn)。目的本課題擬通過(guò)腹腔注射四氯化碳的方法構(gòu)建大鼠肝纖維化模型,予持續(xù)alamandine腹腔泵入治療,探討alamandine對(duì)大鼠肝纖維化的總體作用以及組織中氧化應(yīng)激和自噬的影響。通過(guò)進(jìn)一步體外研究alamandine對(duì)大鼠原代HSC內(nèi)氧化應(yīng)激及自噬的影響,明確肝纖維化的可能機(jī)制,為臨床干預(yù)肝纖維化提供新的靶點(diǎn)和策略。方法1、SD 大鼠隨機(jī)分為 Vehile 組(oil 組)、cc14 組、ALA 組、ccl4+ALA 組、ccl4+3MA組、cc14+Rapa組;4周后取肝組織和血液標(biāo)本。對(duì)肝組織進(jìn)行HE染色、Masson染色、羥脯氨酸測(cè)定、免疫組化、Western blot、H202檢測(cè)以及血液標(biāo)本ALT、AST檢測(cè),評(píng)價(jià)各組氧化應(yīng)激、自噬和肝纖維化水平。2、原代 HSC 分為對(duì)照組、AngⅡ組、alamandine 組、AngⅡ+ alamandine組。qRT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RAS組分表達(dá)水平變化。3、探索alamandine對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HSC活化和膠原生成的影響,Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)COL1A、α-SMA和CTGF等膠原相關(guān)蛋白表達(dá)水平。用MrgD受體抑制劑D-Pro7-Ang-(1-7)、MrgD受體激動(dòng)劑β-alanine以及MrgD siRNA抑制或者刺激MrgD受體后,檢測(cè)膠原相關(guān)蛋白表達(dá)水平。4、探索alamandine對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響,Western blot檢測(cè)NOX4蛋白表達(dá)水平,酶標(biāo)儀檢測(cè)ROS含量,H202試劑盒檢測(cè)H2O2的含量,Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HSC的遷移情況。分別用NOX4 siRNA和MrgD siRNA轉(zhuǎn)染HSC后,Western blot檢測(cè)NOX4和膠原相關(guān)蛋白表達(dá)水平。5、探索AngⅡ和alamandine對(duì)HSC自噬的調(diào)控,Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬通路蛋白表達(dá)水平,透射電子顯微鏡(TEM)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬體情況,mRFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染HSC后共聚焦顯微鏡觀察自噬流情況,LC3 siRNA和NOX4 siRNA轉(zhuǎn)染HSC后檢測(cè)自噬蛋白和膠原相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1、與對(duì)照組(Vehile組)相比,ccl4組肝內(nèi)氧化應(yīng)激、自噬、肝纖維化指標(biāo)均顯著增高;與cc14組相比,ccl4+ALA組和ccl4+3MA組肝內(nèi)氧化應(yīng)激、自噬、肝纖維化指標(biāo)均明顯降低;與ccl4組大鼠相比,cc14+Rapa組肝內(nèi)氧化應(yīng)激、自噬、肝纖維化指標(biāo)均有增高。2、Ang Ⅱ刺激后,原代HSC內(nèi)ACE和AT1R的表達(dá)明顯升高,ACE2和MrgD的表達(dá)降低;alamandine刺激后,原代HSC內(nèi)ACE2和MrgD的表達(dá)明顯升高,ACE和AT1R的表達(dá)降低。3、Alamandine與Ang-(1-7)作用相似,均可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的原代HSC活化和膠原生成;而這一抑制作用被alamandine的受體MrgD阻斷劑D-Pro7-Ang-(1-7)解除,但不能被MAS受體阻斷劑A779解除。MrgD受體激動(dòng)劑β-alanine亦能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HSC活化和膠原生成。MrgD受體被siRNA沉默后,alamandine以及β-alanine都不能抑制AngⅡ的誘導(dǎo)作用。4、Alamandine抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HSC內(nèi)ROS、H202生成和NOX4蛋白表達(dá)。抗氧化劑NAC和NOX4抑制劑VAS2870亦可抑制Ang Ⅱ的誘導(dǎo)作用。干擾NOX4或者M(jìn)rgD后,NOX4、COL1A、α-SMA和CTGF的蛋白表達(dá)水平顯著降低。5、透射電鏡、自噬流和Western blot結(jié)果均提示:AngⅡ刺激后HSC內(nèi)自噬水平明顯增加;alamandine可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HSC自噬激活,而這一抑制作用被D-Pro7-Ang-(1-7)解除。NAC和VAS2870亦可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的自噬水平升高。干擾LC3或者NOX4后,HSC內(nèi)自噬水平降低,HSC活化和膠原生成被抑制。結(jié)論1.外源性持續(xù)腹腔泵入alamandine能夠抑制四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化,并能減輕肝組織氧化應(yīng)激和自噬水平。2.AngⅡ通過(guò)誘導(dǎo)由NOX4介導(dǎo)的ROS生成激活HSC自噬,促進(jìn)HSC活化和膠原生成。3.Alamandine通過(guò)抑制NOX4介導(dǎo)的ROS生成調(diào)控HSC自噬,阻斷AngⅡ的誘導(dǎo)作用。4.結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道及本課題研究結(jié)果,我們推斷在alamandine影響肝纖維化的作用機(jī)制中,可能存在如下信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(如圖):
【圖文】：

結(jié)果輕。逡逑－１－１邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｐｉｃｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋ｌｉｖｅｒ邋ｓｅｃｔｉｏｎｓ邋ｆｒｏｍ邋Ｖｅｈｉｃｌｅ，邋ｃｃｌ４，邋ＡＬＡ，邋ｃｃｌ４邋ｐｌｕｓ邋Ａ３ＭＡ邋ａｎｄ邋ｃｃｌ４邋ｐｌｕｓ邋Ｒａｐａ邋ｓｔａｉｎｅｄ邋ｗｉｔｈ邋Ｈ＆Ｅ（Ｏｒｉｇｉｎａｌ邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：邋ｘ２００）．邋Ｔｈｅｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｗａｓ邋ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ邋ｉｎ邋ｖｅｈｉｃｌｅ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｎｄ邋ＡＬＡ邋ｇｒｏｕｐ，邋ｗｉｔｈｏｕｔ邋ｉｎｆｌａｍｍａｔａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃｏｌｌａｇｅｎ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．邋Ｔｈｅ邋ｈｅｐａｔｉｃ邋ｌｏｂｕｌｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｗａｓ邋ｄａｍａｇｅｄ邋ｉｎ邋ｃｃｌ４邋ｇＲａｐａ邋ｇｒｏｕｐ，邋ｗｉｔｈ邋ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃｏｌｌａｇｅｎ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，邋ｅｓｐｅｌ邋ａｒｅａ．邋Ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｃｌ４邋ｇｒｏｕｐ，邋ｔｈｅ邋ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｈｅｐａｔｉｃ邋ｌｏｂｕｌｅ邋ｗｅｓ邋ｉｎ邋ｃｃｌ４＋Ｒａｐａ邋ｇｒｏｕｐ．邋Ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｃｌ４邋ｇｒｏｕｐ，邋ｔｈｅ邋ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆｅ邋ｗｅｒｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｌｉｇｈｔｅｎｅｄ邋ｉｎ邋ｃｃｌ４＋ＡＬＡ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｎｄ邋ｃｃｌ４＋３ＭＡ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑Ｖｅｅ逡逑

ＩＨＳＡＫ邐Ｍｅｔａｖｉｒ逡逑圖１－１－２．各組肝組織肝纖維化丨ＳＨＡＫ評(píng)分和Ｍｅｔａｖｉｒ評(píng)分。結(jié)果提示：與Ｖｅｈｉｃｌｅ組和ＡＬＡ逡逑組相比，ｃｄ４組的肝纖維化評(píng)分明顯增高；而外源性持續(xù)腹腔泵入Ａｌａｍａｎｄｉｎｅ（ｃｄ４＋ＡＬＡ組）逡逑可減輕肝纖維化程度。予自噬誘導(dǎo)處理后，ｃｃｌ４＋Ｒａｐａ組肝纖維化評(píng)分較ｃｃｌ４組增高；而予逡逑自噬抑制處理后，ｃｃｌ４＋３ＭＡ組肝纖維化評(píng)分較ｃｃｌ４組降低（＊提示與Ｖｅｈｉｃｌｅ組相比，Ｐ＜０．０５；逡逑＃提示與ｃｃｌ４組相比，，Ｐ＜０．０５）。逡逑Ｆｉｇ．ｌ－ｌ－２．Ｔｈｅ邋ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｌｉｖｅｒ邋ｆｉｂｒｏｓｉｓ邋ｗｉｔｈ邋ＩＳＨＡＫ邋ａｎｄ邋Ｍｅｔａｖｉｒ邋ｓｃｏｒｅ．邋Ａｌｌ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ａｓｓａｙｓ逡逑ｗｅｒｅ邋ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ邋ｉｎ邋ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ．邋Ｔｈｅ邋ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ邋ａｓ邋ｍｅａｎ邋土邋ＳＥＭ．邋＊ｐ＜０．０５邋ｖｅｒｓｕｓ邋Ｖｅｈｉｃｌｅ逡逑ｇｒｏｕｐ；＂邋ｐ＜０．０５邋ｖｅｒｓｕｓ邋ｔｈｅ邋ｃｃｌ４邋ｇｒｏｕｐ．逡逑１．２大鼠肝組織Ｍａｓｓｏｎ染色計(jì)算膠原面積逡逑ＳＤ邋大鼠隨機(jī)分為邋Ｖｅｈｉｌｅ邋組（ｏｉｌ邋組）、ｃｃｌ４邋組、ＡＬＡ邋組、ｃｃｌ４＋ＡＬＡ邋組、ｃｃｌ４＋３ＭＡ逡逑組、ｃｃｌ４＋Ｒａｐａ組
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R575

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本文編號(hào)：2639968