【摘要】：據(jù)統(tǒng)計,高甘油三脂血癥性胰腺炎(hypertriglyceridemia pancreatitis,HTGP)近年來已成為我國急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)的第三大病因,但其發(fā)病機制至今尚未闡明。高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia,HTG)時游離脂肪酸(free fatty acids,FFAs)對胰腺腺泡細胞的毒性作用和細胞鈣內超載導致的腺泡細胞損傷是目前公認的HTGP發(fā)病機制。但以上研究均聚焦于胰腺腺泡細胞。胰腺導管上皮細胞及其分泌物構成了一特殊結構-胰管黏膜屏障(pancreatic ductal mucosa barrier,PDMB)。同時,胰腺導管上皮細胞延伸至腺泡腔與腺泡細胞相鄰。本課題組前期的動物實驗表明:在雨蛙肽腹腔注射誘導的HTGP大鼠AP模型胰腺組織中肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light-chain kinase,MLCK),L型鈣離子通道Cav1.2表達上調及緊密連接(tight junction,TJ)改變[1,2],結合文獻報道:高甘油三酯血癥大鼠模型中胰腺腺泡細胞無明顯脂肪變[3]。我們推測FFAs可能通過對胰腺導管上皮細胞及其構成的PDMB產生損傷而導致HTGP發(fā)病。而MLCK,Ca2+通道及TJ是否參與其中?本文將展開初步研究。第一部分高脂環(huán)境對胰腺導管上皮細胞MLCK及細胞間緊密連接的影響目的:用油酸(oleic acid,OA)和軟脂酸(palmitic acid,PA)與HPDE6C7細胞共培養(yǎng),模擬體內的高脂環(huán)境,觀察在高脂環(huán)境下HPDE6C7細胞中MLCK,TJ相關蛋白和Ca2+通道m(xù)RNA的表達水平變化。方法:分別用不同濃度的OA(100,200,300,400,500μM/L)和PA(100,200,300,400,500μM/L)處理HPDE6C7細胞24h。采用CCK-8法檢測細胞增殖;q PCR法檢測MLCK、ZO-1、Claudin-2、Occludin、Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1、Cav2.2、Cav3.1、Cav3.2的mRNA表達水平。結果:1.(1)OA:在濃度為300μM,400μM和500μM時抑制HPDE6增殖,以500μM時抑制最明顯(P0.05)。(2)PA:在濃度為200μM,300μM,400μM和500μM時抑制HPDE6增殖,以500μM時抑制最明顯(P0.05)。2.(1)OA:在濃度為400μM增加MLCK mRNA表達(P0.05);濃度為300μM時抑制Occludin mRNA表達(P0.05);不同濃度OA均抑制ZO-1 mRNA表達(P0.05),且對Claudin-2 mRNA表達無影響(P0.05)。(2)PA:增加MLCK mRNA表達,呈濃度依賴性(P0.05);PA在濃度為200μM時抑制Claudin-2和Occludin mRNA表達(P0.05);在濃度為100μM-300μM抑制ZO-1 mRNA表達(P0.05)。3.(1)OA:濃度在400μM和500μM時增加Cav2.2 mRNA表達(P0.05);OA濃度在300μM,400μM和500μM時增加Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1、Cav3.1mRNA表達(P0.05);不同濃度OA對Cav3.2無影響(P0.05)。(2)PA:濃度在200μM和500μM增加Cav1.2和Cav2.1 mRNA表達(P0.05);PA濃度在300μM,400μM和500μM時增加Cav2.2和Cav3.2 mRNA表達(P0.05);PA濃度在200μM,300μM,400μM和500μM時增加Cav1.3和Cav3.1mRNA表達(P0.05)。結論:1.OA和PA抑制人胰腺導管上皮細胞系HPDE6C7細胞增殖,以500μM時抑制作用最明顯。2.OA和PA上調HPDE6C7細胞中MLCK及Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1、Cav2.2、Cav3.1 mRNA表達,減少ZO-1、Occludin和Claudin-2 mRNA表達。第二部分MLCK在雨蛙肽誘導的HTGP胰腺導管上皮細胞模型中的表達變化目的:用雨蛙肽(caerulin,CAE)刺激與PA共培養(yǎng)的HPDE6C7細胞,模擬體內HTGP的發(fā)病過程,結合ML-7干預。觀察上述條件對細胞中MLCK,TJ相關蛋白和Ca2+通道的影響。方法:用濃度為200μM的PA與HPDE6C7細胞共培養(yǎng)24h后加入CAE和ML-7預處理。用q PCR檢測MLCK、ZO-1、Claudin-2、Occludin、Cav1.2、Cav1.3的mRNA表達水平。Western Blot法檢測MLCK、ZO-1、Claudin-2和Occludin蛋白表達水平。FITC-Dextran法檢測單層HPDE6C7細胞通透性。直接免疫熒光法觀察細胞微絲結構。結果:1.與PA共培養(yǎng)時:MLCK蛋白和mRNA表達上調,Cav1.2和Cav1.3mRNA表達上調;ZO-1、Claudin-2、Occludin蛋白和mRNA表達減少,(P0.05);HPDE6C7細胞通透性增高,局部微絲排列紊亂。2.CAE刺激后:MLCK蛋白和mRNA表達繼續(xù)上調,與PA組比較,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。ZO-1、Claudin-2和Occludin mRNA表達減少,與control組比較,有統(tǒng)計學意義(P0.05);與PA組比較,Claudin-2 mRNA表達減少,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Cav1.2和Cav1.3 mRNA上調,但與PA組比較無統(tǒng)計學意義(P0.05)。ZO-1、Claudin-2和Occludin蛋白表達表達下調,與control組比較,有統(tǒng)計學意義(P0.05),其中ZO-1和Occludin蛋白表達下調,與PA組比較有統(tǒng)計學意義(P0.05)。單層HPDE6C7細胞通透性增高,正常微絲結構破壞,微絲解聚,網狀結構坍塌。3.ML-7干預組:MLCK蛋白和mRNA表達減少,與PA+CAE組比較,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Cav1.2和Cav1.3 mRNA表達與PA+CAE組兩兩比較,無統(tǒng)計學意義(P0.05)。ZO-1、Claudin-2和Occludin蛋白和mRNA表達上調,其中ZO-1與Occludin蛋白和mRNA上調與PA+CAE組比較,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。HPDE6C7細胞通透性降低,微絲結構排列紊亂,破壞程度較PA+CEA組輕。結論:1.CAE導致高脂環(huán)境下HPDE6C7細胞MLCK蛋白和mRNA表達增多,ZO-1、Claudin-2、Occludin蛋白和mRNA表達減少,微絲正常結構破壞,細胞通透性增高。2.MLCK抑制劑可改善CAE刺激后高脂環(huán)境下HPDE6C7細胞微絲結構破壞,增加ZO-1、Claudin-2、Occludin蛋白和mRNA表達,降低細胞通透性。3.PA和PA+CEA均能上調Cav1.2和Cav1.3 mRNA表達,但兩者相比無統(tǒng)計學意義,ML-7對此無抑制作用。第三部分干擾MLCK基因對HTGP胰腺導管上皮細胞通透性及緊密連接影響的初步研究目的:使用慢病毒介導的RNA干擾技術,對人胰腺導管上皮細胞系HPDE6C7細胞的MLCK基因進行mi RNA干擾,構建帶EGFP報告基因的慢病毒載體;用構建的MLCK-mi RNA載體轉染HPDE6C7細胞,形成穩(wěn)定轉染的細胞系,并與PA和CAE共培養(yǎng),觀察單層胰腺導管上皮細胞通透性及TJ相關蛋白表達變化。方法:1.克隆人源MLCK基因,連接到經Asc I和Pme I酶切后p Lenti6.3-EGFP載體上,構建p Lenti6.3-EGFP-MLCK重組質粒,轉染293T細胞,包裝慢病毒;用慢病毒感染人胰腺導管上皮細胞系HPDE6C7,殺瘟稻素(blasticidin,BSD)篩選穩(wěn)轉細胞株,q PCR驗證轉染效果。2.將篩選成功的MLCK-mir-HPDE6C7細胞與空載慢病毒的陰性對照組和正常HPDE6C7細胞與PA共培養(yǎng),CAE刺激后用Western Blot法檢測MLCK、ZO-1、Claudin-2和Occludin蛋白表達水平。FITC-Dextran法檢測單層HPDE6C7細胞通透性。結果:1.經測序鑒定證實成功構建人源MLCK基因的mi RNA慢病毒干擾載體及重組質粒;共轉染293T細胞產生的重組慢病毒顆粒感染HPDE6C7細胞后高表達綠色熒光;BSD篩選14天q PCR顯示mi RNA慢病毒轉染組MLCK mRNA表達較空白對照組和陰性對照組明顯下降(P0.05);2.L+PA組和L+PA+CEA組中MLCK蛋白表達較其他組低,有統(tǒng)計學意義(P0.05);3.與control組相比,LNC+PA組和LNC+PA+CEA組中MLCK蛋白表達升高,細胞通透性升高,Claudin-2、Occludin、ZO-1蛋白表達降低,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.與LNC+PA+CEA組相比,L+PA組和(或)L+PA+CEA組中Claudin-2、Occludin、ZO-1蛋白表達升高,細胞通透性降低(P0.05),有統(tǒng)計學意義。結論:1.成功建立穩(wěn)定干擾MLCK基因的HPDE6C7細胞系。2.干擾HPDE6C7細胞MLCK基因表達后,HTGP胰腺導管上皮細胞模型通透性降低,TJ相關蛋白表達上調。
【圖文】：

（1）OA在濃度為100μM和200μM對HPDE6C7細胞無抑制增殖作用（P＞0.05）；在濃度為300μM，400μM和500μM時均可抑制HPDE6C7增殖，以500μM時抑制最明顯（P＜0.05），見圖1-1A。（2）PA在濃度為100μM時對HPDE6C7細胞無抑制增殖作用（P＞0.05）；在濃度為200μM，300μM，400μM和500μM時均可抑制HPDE6C7增殖，，以500μM時抑制最明顯（P＜0.05），見圖1-1B。圖1-1油酸和軟脂酸對HPDEC7細胞增殖的抑制A.不同濃度油酸對HPDEC7細胞增殖的抑制 B. 不同濃度軟脂酸對HPDEC7細胞增殖的抑制Fig 1-1 Inhibition effects of oleic acid and palmitic acid on HPDEC7A. Inhibition effects of different concentration of oleic acid；B.Inhibition effects of different concentrationof palmitic acid* vs control group P＜0.05真努力奮斗才能夢想成真努力奮斗才能夢想成真努力奮斗才能夢想成真努力奮斗才能夢想成真努力奮斗才能夢想成真努力奮斗才能夢想成真努力奮斗?

腺炎胰腺導管上皮細胞中作用的初步研究 博士學位論文34圖1-3 油酸和軟脂酸對Ca2+通道 mRNA表達影響A、C、E、G、I、K:油酸對Cav1.2、Cav1.3、Cav2.2、cav2.1、Cav3.1、Cav3.2 mRNA表達影響B(tài)、D、F、H、J、L:軟脂酸對Cav1.2、Cav1
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R576

【參考文獻】

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10 黃薇;陳楨s

本文編號：2639933