發(fā)布時(shí)間：2020-04-24 23:30

【摘要】： 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)所致的丙型肝炎易于慢性化,是引起慢性肝病的主要原因之一。目前全球約有1.7億HCV感染者。丙型肝炎與肝硬化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān),嚴(yán)重危害人類健康,已成為全球性的、重要的公共衛(wèi)生問題。迄今,HCV感染發(fā)病的機(jī)制尚不完全清楚,仍然缺乏有效的治療方法,疫苗的研究也遇到很大障礙。 HCV是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒,屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬。包膜病毒感染細(xì)胞的初始步驟即是病毒外膜與靶細(xì)胞膜結(jié)合并相互作用的過程,目前初步認(rèn)為低密度脂蛋白受體(LDLR)、CD81、B族I型清道夫受體(SR-BI),claudin-1等多種宿主細(xì)胞膜分子參與其中,但由于一直以來都缺乏合適的研究模型,這些分子的角色認(rèn)定尚缺乏有力證據(jù),其具體作用機(jī)制也不十分清楚。而深入研究論證HCV入胞相關(guān)的宿主因子,有助于加深對(duì)HCV感染發(fā)病機(jī)制的理解,為抗病毒治療尋找新的靶點(diǎn)。HCV進(jìn)入細(xì)胞后,通過復(fù)制,合成,裝配等過程最終釋放出成熟的病毒顆粒。理論上完整的包膜病毒顆粒由核衣殼及外膜組成,但由于獲取HCV顆粒存在一定困難且不同來源的病毒顆粒在大小和形態(tài)上存在顯著差異,目前對(duì)HCV顆粒的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)尚無定論。因此,進(jìn)一步了解HCV顆粒在感染細(xì)胞中的形態(tài)和分布特征及感染細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)的病理改變,有利于更加直觀的認(rèn)識(shí)病毒的生命周期及其在復(fù)制成熟過程中與哪些宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在緊密聯(lián)系,為尋找更有效抑制病毒感染的新途徑提供依據(jù)。 2005年Rockefeller大學(xué)HCV研究中心主任Charles M. Rice教授領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室建立了HCV細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),在一定程度解決了長期制約HCV研究的缺乏理想模型這一瓶頸問題。在Rice實(shí)驗(yàn)室的幫助和指導(dǎo)下,我們構(gòu)建了丙型肝炎病毒體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(HCV cell-culture system, HCVcc)。以此系統(tǒng)為平臺(tái),我們對(duì)HCV顆粒在感染細(xì)胞中的超微形態(tài)及感染細(xì)胞自身的病理改變進(jìn)行觀察研究,并進(jìn)一步論證了CD81和SR-BI兩種宿主表面分子在HCV感染中的重要作用。 本實(shí)驗(yàn)主要完成了以下三個(gè)方面的工作: 1 HCV細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的建立與鑒定 將Rice教授惠贈(zèng)的含有全長HCV嵌合基因組的質(zhì)粒pFL-J6/JFH體外轉(zhuǎn)錄為HCV RNA,電穿孔轉(zhuǎn)染至Huh-7.5細(xì)胞,檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HCV mRNA及蛋白的表達(dá),測定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒數(shù)量;收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育原始(na?ve)Huh-7.5細(xì)胞,測定并計(jì)算培養(yǎng)上清中HCV的感染性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)有HCV mRNA及蛋白表達(dá),細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有高水平的病毒拷貝數(shù),感染性測定培養(yǎng)上清的TCID50/ml為6.98×104。結(jié)果表明成功建立了HCV體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)并獲得有感染性的HCV。 2 HCVcc感染原始(na?ve)Huh7.5細(xì)胞的透射電鏡觀察 收獲轉(zhuǎn)染HCV RNA的細(xì)胞培養(yǎng)上清,與原始的Huh7.5細(xì)胞共孵育后制成超薄切片,透射電子顯微鏡觀察感染細(xì)胞內(nèi)HCV的形態(tài)結(jié)構(gòu)和分布特征,以及宿主本身結(jié)構(gòu)的變化。用專業(yè)軟件測量觀察到的HCV顆粒直徑及病毒感染細(xì)胞前后的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔內(nèi)徑,應(yīng)用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。透射電子顯微鏡觀察到HCVcc感染后的Huh7.5細(xì)胞胞質(zhì)中含有大量的球形病毒樣顆粒,直徑在33-52nm之間,且多分布在核周的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近;感染細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)黃病毒科病毒感染后的特征性改變,如粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量增加,管腔擴(kuò)張,胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)和含有大量HCV顆粒的包涵體等。形態(tài)學(xué)的研究不僅進(jìn)一步證明了HCV細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的可靠性,也更加直觀的顯示了HCV顆粒在肝源細(xì)胞內(nèi)的形態(tài)分布特征及其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的密切聯(lián)系。 3 siRNA干擾CD81及SR-BI的表達(dá)對(duì)HCVcc易感性的影響 使用化學(xué)合成的靶向CD81及SR-BI的siRNA序列分別轉(zhuǎn)染Huh-7.5細(xì)胞,抑制Huh7.5細(xì)胞表面分子CD81或SR-BI的表達(dá),檢測轉(zhuǎn)染前后Huh-7.5細(xì)胞對(duì)HCVcc易感性的變化。結(jié)果顯示siRNA可有效的干擾CD81或SR-BI的表達(dá),而CD81或SR-BI表達(dá)缺陷的Huh-7.5細(xì)胞對(duì)HCVcc的易感性明顯下降,說明CD81和SR-BI都在HCV感染入胞過程中發(fā)揮了重要作用,是HCV感染的必要條件。
【圖文】：

HCV入胞示意圖

1.4 HC 染-PCRV J6/JFH RNA 轉(zhuǎn)錄本電轉(zhuǎn)染 Huh-7.5 細(xì)胞后 NS5A 24 h后，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR可檢測到細(xì)胞培養(yǎng)上清中HC，為 6.4×106copies，，直至 72 h，HCV含量基本維持同一圖 1.5 Huh-7.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 FL-J6/JFH 轉(zhuǎn)錄本后培養(yǎng)上清中 HCV 含性檢測○A ○B(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R512.63

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張久聰;丙型病毒性肝炎母嬰傳播機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2639502