【摘要】： 目的：非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指與過量飲酒無關(guān)的,以肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性和脂質(zhì)貯積為主的臨床病理綜合征。NAFLD的發(fā)病率逐年上升,發(fā)病年齡逐漸年輕化,已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。然而NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未明確,臨床上仍無有效的治療手段。目前研究發(fā)現(xiàn),肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid-binding protein, L-FABP)與高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、肥胖、2-型糖尿病等的形成密切相關(guān)。為此,本實(shí)驗(yàn)通過高脂飲食建立非酒精性脂肪肝大鼠模型,來觀察L-FABP在NAFLD形成過程中的表達(dá),初步探討L-FABP在NAFLD發(fā)病機(jī)制中的作用；同時(shí)觀察降脂益肝沖劑對肝組織中L-FABP mRNA表達(dá)的影響,探討其可能的分子治療機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供更加可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1.造模與取材雄性清潔級Wistar大鼠80只,重量約為160-220g,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,開始正式實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為8組,每組10只,其中正常組(N1,N2,N3組)以普通飼料喂養(yǎng),模型組(M1,M2,M3組)和治療組(D1,D2組)以高脂飼料喂養(yǎng)。每天8：00～9：00am,4：00～5：00pm為喂食和給藥的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水,治療D1組在給予高脂飲食喂養(yǎng)的同時(shí)即給予降脂益肝沖劑16g·Kg-1·d-1(按成年人60kg體質(zhì)量的劑量(40g／d)計(jì)算出大鼠藥物劑量),分2次灌胃(ig),共8周；治療D2組于8周末時(shí)給予降脂益肝沖劑,ig(劑量、用法同D1組),共4周。同時(shí)模型組和正常組分別給予等量的生活飲用水,ig。在實(shí)驗(yàn)第4周末處死正常組(N1組)、模型組(M1組)；在實(shí)驗(yàn)第8周末處死正常組(N2組)、模型組(M2組)和治療組(D1組)大鼠,于12周末處死其余組大鼠。所有大鼠處死前均隔夜禁食并用水合氯醛麻醉,腹主動(dòng)脈采血,各組大鼠于肝左葉相同部位留取O.1g組織置于1.5mL EP管,-70℃冰箱凍存,用于RT-PCR的檢測；另取肝右葉相同部位(1cm×1cm×0.5cm)組織,在4%多聚甲醛中固定,常規(guī)制片、HE染色。 2.檢測指標(biāo)：測量各實(shí)驗(yàn)鼠的體重、肝脾濕重及體長,并計(jì)算肝脾比值、肝指數(shù)及Lee's指數(shù)等體質(zhì)指標(biāo)；將采集的全血用低溫離心機(jī)迅速分離血漿,丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血脂(TC,TG)以及肝組織脂質(zhì)含量在全自動(dòng)生化分析儀(Olympus Au1000)上測定；采用銅染色法測定血清和肝組織中的FFA水平；采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖(FBG)；空腹胰島素(FINS)測定步驟按照放免試劑盒操作步驟進(jìn)行,并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI=ln (1/(FINS×FBG)));在光鏡下評估脂肪變性的程度；半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)測定L-FABP mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)。 結(jié)果：1.正常組(N1,N2,N3組)肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞呈多邊形,圍繞中央靜脈呈放射狀,肝竇清晰可見,肝索排列整齊；各項(xiàng)檢測指標(biāo)均在正常范圍內(nèi),并可觀察到L-FABP mRNA的表達(dá)。 2.造模4周末(M1組),模型組肝組織呈現(xiàn)輕度脂肪變性；血清轉(zhuǎn)氨酶較正常組有所升高；總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、FFA升高,開始出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂；FBG, FINS開始升高,ISI有所下降,出現(xiàn)輕度胰島素抵抗；肝組織L-FABP mRNA的表達(dá)較其正常組升高。 3.造模8周末(M2組),模型組肝組織呈中度脂肪變性及部分氣球樣變,形成單純性脂肪肝,肝脂肪變以大泡性為主；血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT, AST)、血脂(TC, TG, FFA)較正常組顯著升高；肝組織L-FABP mRNA的表達(dá)較其同期正常組顯著升高(P0.01)。 4.造模12周末(M3組),模型組肝組織脂肪變加劇并出現(xiàn)肝細(xì)胞完全氣球樣變、小葉內(nèi)混合有炎癥細(xì)胞浸潤以及散在的點(diǎn)狀壞死；與正常組相比,血清轉(zhuǎn)氨酶、總膽固醇、甘油三酯較正常組顯著升高；與正常組相比,肝組織L-FABP mRNA的表達(dá)顯著升高(P0.01)。 5.用藥組(D1組),在細(xì)胞形態(tài)、血脂、轉(zhuǎn)氨酶及肝組織肝型脂肪酸結(jié)合蛋白的表達(dá)量,與正常組(N1組)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但與4周模型組Ml相比,各項(xiàng)指標(biāo)均有所改善,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。 6.用藥組(D2組),肝組織仍可見索條狀排列的肝細(xì)胞,脂變程度較同期模型組明顯減輕,僅有輕微的炎性細(xì)胞浸潤,未見明顯壞死灶；與M2組相比,ALT, AST, TC, TG明顯降低,FBG, FINS亦顯著降低,L-FABP mRNA的表達(dá)量明顯下調(diào)(P0.01)。 結(jié)論：1.高脂高膽固醇飲食可成功的復(fù)制NAFLD大鼠模型；胰島素抵抗及脂質(zhì)代謝紊亂與NAFLD的發(fā)生關(guān)系密切。 2.正常大鼠肝臟可表達(dá)L-FABP mRNA, NAFLD模型的大鼠L-FABP mRNA增高,且隨造模時(shí)間延長表達(dá)量明顯升高,其增高的程度與NAFLD的程度呈正相關(guān)。 3.在NAFLD早期,給予降脂益肝沖劑,可有效的預(yù)防NAFLD的發(fā)病。 4.降脂益肝沖劑可使ALT, AST, TC, TG, FFA顯著降低,說明該藥不僅能夠逆轉(zhuǎn)肝臟的脂質(zhì)沉積,而且具有很好的降酶保肝的作用；可使FBG, FINS顯著降低,證實(shí)該藥物可通過有效的改善胰島素抵抗來達(dá)到對NAFLD良好的治療效果；而L-FABP mRNA的表達(dá)明顯降低,表明降脂益肝沖劑可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,減輕肝細(xì)胞的脂肪變性,從而達(dá)到治療目的。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R575.5

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本文編號：2638760