【摘要】： 胃食管反流病(Gastroesophageal reflux disease,GERD)包括非糜爛性反流病(non-erosive esophageal reflux disease,NERD)、反流性食管炎(reflux esophagitis,RE)和Barrett食管(Barrett Esophagus ,BE),是危害人們健康的常見(jiàn)疾病,嚴(yán)重者可發(fā)展成為食管腺癌。因GERD及其并發(fā)Barrett食管和食管腺癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確,從一定程度上影響了對(duì)它們的診斷和治療。Claudin蛋白家族是近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)的穿膜蛋白,是緊密連接最重要的組成部分,維持著緊密連接的特有的屏障功能和柵欄功能。在正常食管粘膜,claudin 3和claudin 4蛋白基本不表達(dá);而在腸化的BE食管上皮細(xì)胞和食管腺癌組織中,二者表達(dá)明顯增高。NERD和RE是我國(guó)GERD最主要的2個(gè)亞型,然而迄今對(duì)claudin 3、4在NERD和RE患者食管粘膜中的表達(dá)變化規(guī)律及其影響因素尚不清楚,在BE表達(dá)增高的信號(hào)機(jī)制也未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。為此,本課題重點(diǎn)進(jìn)行4方面的研究:1.采用RT-PCR、western blot和免疫組織化學(xué)等方法,分別對(duì)claudin 3、4在正常食管、NERD、RE和BE粘膜上皮的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),以此初步探討其在GERD臨床診斷和治療中的意義;2.采用便攜式24h pH監(jiān)測(cè)儀及便攜式24 h膽紅素監(jiān)測(cè)儀,對(duì)NERD和RE患者食管內(nèi)pH及膽紅素實(shí)行24h雙監(jiān)測(cè),并用RT-PCR法檢測(cè)被測(cè)食管粘膜內(nèi)claudin 4 mRNA的表達(dá)變化,以此探討胃酸和膽汁酸反流與食管粘膜claudin 4表達(dá)的聯(lián)系;3.采用MTT法檢測(cè)胃酸、膽汁酸和TNF-α對(duì)小腸癌上皮細(xì)胞株活力的影響,以此選定合適的實(shí)驗(yàn)條件,再分別采用實(shí)時(shí)-PCR和激光共聚焦的方法,觀察胃酸、膽汁酸和TNF-α對(duì)小腸癌上皮細(xì)胞株claudin 4mRNA和蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞內(nèi)分布的直接影響。4.采用p38激酶特異性拮抗劑(SB203580),通過(guò)阻斷p38激酶活化前后,western blot法檢測(cè)胃酸、膽汁酸誘導(dǎo)的claudin 4蛋白表達(dá)的變化,以此研究p38激酶信號(hào)在胃酸和膽汁酸誘導(dǎo)的小腸上皮細(xì)胞claudin 4表達(dá)變化中的作用。主要結(jié)果如下: 1.對(duì)80例GERD患者食管粘膜進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)claudin 3在正常食管,在NERD和RE的上皮,無(wú)論是mRNA,還是蛋白水平,不表達(dá)或微弱局灶表達(dá);在腸化型BE上皮,claudin 3明顯高表達(dá)。claudin 4在正常食管上皮微弱或不表達(dá),而在NERD、RE和BE表達(dá)在mRNA和蛋白水平逐漸增強(qiáng)。免疫組化還發(fā)現(xiàn)claudin 3、4的著色在NERD和RE粘膜上皮主要在細(xì)胞膜;對(duì)于BE,二者不僅胞膜,胞漿內(nèi)也出現(xiàn)陽(yáng)性著色。 2.對(duì)其中的48例GERD患者進(jìn)行食管胃酸和膽紅素監(jiān)測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)NERD組以無(wú)反流為主, RE組以混合反流為主,二者構(gòu)成比相差顯著;NERD組和RE組在pH4總時(shí)間%、pH4臥位時(shí)間%、酸反流次數(shù)、DeMeester積分、abs0.14臥位時(shí)間%和膽汁反流次數(shù)等6個(gè)參數(shù)上存在明顯差別(P0.05);RE組食管粘膜claudin 4 mRNA的含量顯著高于NERD。單獨(dú)酸反流、單獨(dú)膽汁反流和混合反流組claudin 4 mRNA均顯著高于無(wú)反流組(P0.05),單獨(dú)酸反流和單獨(dú)膽汁反流之間相差不顯著(P0.005),混合反流組含量最高,顯著高于其他各組(P0.05);GERD患者食管粘膜claudin 4 mRNA的含量與pH4臥位時(shí)間%、酸反流次數(shù),DeMeester積分,以及abs0.14臥位時(shí)間%和膽汁反流次數(shù)等5個(gè)參數(shù)明顯相關(guān)。 3. MTT法結(jié)果顯示pH選取的范圍在pH 5.5～7.4,鵝脫氧膽酸(CDCA)50μM～200μM對(duì)小腸癌細(xì)胞株活力無(wú)明顯毒性,可以作為合適的研究條件。激光共聚焦結(jié)果顯示CDCA或鹽酸隨著作用時(shí)間增加和濃度增大, claudin 4 mRNA和蛋白的表達(dá)逐步增加;在刺激因素下蛋白表達(dá)的增強(qiáng)在HIC細(xì)胞內(nèi)彌漫分布;在表達(dá)量和升高的速度上膽汁酸強(qiáng)于胃酸的作用;膽汁酸在pH 6.0的酸性培養(yǎng)基內(nèi)的作用更高于單獨(dú)膽汁酸的作用。TNF-α不同時(shí)間刺激后,claudin 4 mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化。 4.鹽酸、CDCA單獨(dú)或者混合刺激HIC細(xì)胞均可引起p38激酶活化,混合刺激活化p38激酶的程度明顯高于單獨(dú)刺激,同時(shí)伴有claudin 4蛋白表達(dá)的增高,使用p38激酶信號(hào)途徑特異性拮抗劑SB203580,可以抑制p38激酶活化,同時(shí)可以抑制鹽酸或膽汁酸單獨(dú)刺激引起的claudin 4表達(dá)的增高,也可以部分抑制鹽酸和膽汁酸混合刺激引起的表達(dá)增高。 由上述結(jié)果得出以下結(jié)論: 1.提示claudin 4表達(dá)的水平和粘膜病變程度密切相關(guān),它表達(dá)增高有可能是食管粘膜上皮細(xì)胞緊密連接受損傷的標(biāo)志,易引起粘膜損害的進(jìn)一步加重;claudin 3是BE理想的診斷標(biāo)志物和治療的新靶點(diǎn),claudin 3作為BE食管標(biāo)志物的特異性要高于claudin 4。 2.臥位酸、膽汁反流時(shí)間延長(zhǎng),反流的次數(shù)增多更易誘發(fā)RE,聯(lián)合反流的效果更加明顯。膽汁酸可能和胃酸一樣,引起claudin 4的高表達(dá),因而也是獨(dú)立的食管粘膜損傷因子;胃酸、膽汁酸協(xié)同作用,更有致病性。臥位酸、膽汁反流時(shí)間和反流次數(shù)的增加是引起食管claudin 4表達(dá)增高的重要因素。 3.膽汁酸或/和胃酸可能從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平上直接影響barrett食管claudin4的表達(dá),并具有時(shí)間和濃度效應(yīng)。膽汁酸的作用強(qiáng)于胃酸,混合反流效果更加明顯。盡管TNF-α未影響claudin 4的表達(dá),但它在barrett食管的作用還需要進(jìn)一步研究。 4.胃酸、膽汁酸可能直接引起barrett食管的p38激酶活化,進(jìn)而正向調(diào)節(jié)claudin 4蛋白的表達(dá),除了p38激酶信號(hào)外,可能還存有其他調(diào)控機(jī)制參與claudin 4蛋白表達(dá)的增高。
【圖文】：

圖 1 RT-PCR 檢測(cè) GERD 患者圖各組食管粘膜 CLDN3 mRNA 表2、GERD 食管粘膜 claudin4mRNA 表達(dá)水平的變化。GERD 患者食管粘膜 claudin4mRNA 表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖 2、3。正常食管RE 和 BE 食管粘膜 claudin4mRNA 含量分別是 0.14±0.03、0.24±0.10.71±0.20。統(tǒng)計(jì)資料顯示與正常食管粘膜相比，RE、BE 食管粘膜 cla達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，NERD 有增高的趨勢(shì)，，但相差不顯著(P=0.1管粘膜 claudin4 mRNA 表達(dá)水平顯著高于 NERD(P=0.008 和 P=0.000)與 RE 相比相差仍然顯著(P=0.000)。

D 食管粘膜 claudin3 蛋白表達(dá)的變化。stern blot 檢測(cè) GERD 患者食管粘膜 claudin3 蛋白表達(dá)情況膜未見(jiàn)表達(dá)，在 NERD、RE 和 BE 食管粘膜其蛋白含量分別 0.64±0.15，BE 食管粘膜與 NERD 和 RE 相比，claudin3 蛋，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示 BE 粘膜的 claudin3 蛋白表達(dá)量顯NERD 和 RE 之間相差不明顯(P>0.05)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R571

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2638504