【摘要】： 目的:柯里拉京(corilagin)是從葉下珠中提取的有效藥理成分。本研究探討柯里拉京(corilagin)對脂多糖(LPS)刺激的RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞瘤細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子和介質(zhì)的干預(yù)作用。 方法:MTT法檢測柯里拉京(corilagin)對RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞瘤細(xì)胞的最大無毒濃度,采用LPS刺激的RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞瘤細(xì)胞,同時用柯里拉京(corilagin)進(jìn)行干預(yù), ELISA法檢測細(xì)胞上清中TNF-α,IL-1β,IL-6,Il-10的含量,Griess法檢測細(xì)胞上清液中的NO,Real-time PCR法檢測細(xì)胞中TNF-α,COX-2,iNOS,HO-1 mRNA的表達(dá)情況,Western-blotting法檢測細(xì)胞內(nèi)COX-2和HO-1蛋白的表達(dá)。 結(jié)果:MTT法顯示柯里拉京(corilagin)對RAW 264.7細(xì)胞株的最大無毒濃度為0.5mg/L。LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞經(jīng)柯里拉京(corilagin)干預(yù)24小時后,細(xì)胞上清液中的TNF-α,IL-1β和IL-6水平明顯比模型組要低(p0.01)�？吕锢�(corilagin)可以明顯降低經(jīng)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)COX-2蛋白的表達(dá)(p0.01)�？吕锢�(corilagin)不僅可以明顯降低細(xì)胞上清液中一氧化氮的釋放(p0.05),而且可以明顯下調(diào)細(xì)胞中一氧化氮合酶mRNA的表達(dá)(p0.05 or 0.01),并且對IL-10有抑制作用,可促進(jìn)HO-1基因和蛋白的表達(dá)(p0.01)。柯里拉京(corilagin)可以明顯阻止LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)NF-κB的核轉(zhuǎn)位(p0.01)。 結(jié)論:柯里拉京(corilagin)對促炎細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)TNF-α,IL-1β,IL-6,COX-2,NO均有不同程度的抑制作用,并可以阻止NF-κB的核轉(zhuǎn)錄,說明柯里拉京(corilagin)對炎癥的起始階段有明顯的抑制作用。在炎癥的修復(fù)階段,柯里拉京(corilagin)對HO-1的表達(dá)有明顯的促進(jìn)作用,說明此成分有促進(jìn)炎癥恢復(fù)的功效�？吕锢�(corilagin)對IL-10有抑制作用的同時沒有地塞米松誘導(dǎo)凋亡的作用,其機制還需要進(jìn)一步探討�？傊�,從本實驗可以看出,柯里拉京(corilagin)在對LPS刺激下的RAW264.7細(xì)胞分泌的炎性因子和介質(zhì)有不同程度的抑制作用,可以初步說明柯里拉京(corilagin)具有抗炎的作用。 第二部分柯里拉京(corilagin)抗乙肝病毒的作用研究 目的:明確柯里拉京(corilagin)是否有抗乙肝病毒的作用。 方法:MTT法檢測柯里拉京(corilagin)對HepG2.2.15細(xì)胞的最大無毒濃度。采用柯里拉京(corilagin)干預(yù)HepG2.2.15細(xì)胞,實時熒光定量PCR法檢測細(xì)胞上清液中HBV-DNA的分泌量,EIA法檢測細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg。 結(jié)果:處理9d后,80mg/L柯里拉京(corilagin)組OD值與正常HepG2.2.15細(xì)胞組相比有顯著性差異(p0.05),9d時柯里拉京(corilagin)對HepG2.2.15細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為75.85mg/L。各實驗劑量的柯里拉京(corilagin)組分別在3d、6d、9d上清液中分泌的HBV-DNA與正常細(xì)胞組相比無顯著性差異(p0.05)。各實驗劑量的柯里拉京(corilagin)組分別在3d、6d、9d分泌的HBsAg與正常細(xì)胞組相比無顯著性差異(p0.05)。各實驗劑量的柯里拉京(corilagin)組分別在3d、6d、9d分泌的HBeAg與正常細(xì)胞組相比無顯著性差異(p0.05)。 結(jié)論:從結(jié)果來看,實驗濃度的柯里拉京(corilagin)對HepG2.2.15細(xì)胞沒有毒性,在此濃度作用下HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg、HBeAg、HBV-DNA的量沒有受到明顯影響,說明柯里拉京(corilagin)沒有明顯的抗乙肝病毒的作用。 目的:研究葉下珠柯里拉京(Corilagin)提取物對肝內(nèi)膽汁淤積的干預(yù)作用。 方法:給予SD大鼠ANIT造成急性淤膽型肝炎的動物模型,采用葉下珠柯里拉京(Corilagin)提取物灌胃,以地塞米松和熊去氧膽酸(UDCA)作為對照,檢測肝功能,觀察動物生活質(zhì)量,病理切片檢測肝組織病理學(xué)變化,實時熒光定量PCR法檢測核因子Egr-1,趨化因子CINC-1和MIP-2,western-blot法檢測粘附分子ICAM-1,免疫組織化學(xué)法檢測核因子NF-κB轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS表達(dá),ELISA法檢測肝組織和血清中TNF-α和IL-6的水平,采用硝酸還原酶法檢測組織中一氧化氮(NO),硫代巴比妥酸比色法檢測組織中丙二醛(MDA),黃嘌呤氧化酶法檢測組織中超氧化物歧化酶(SOD),比色法檢測組織中髓過氧化物酶(MPO)。 結(jié)果:經(jīng)柯里拉京(corilagin)處理的淤膽型肝炎大鼠的淤膽指數(shù)明顯降低,柯里拉京(corilagin)對AKP,γ-GT和TBA在高峰期或者消退期有作用,但對轉(zhuǎn)氨酶無明顯影響。對急性淤膽型肝炎動物模型的生存狀況也有明顯改善,對肝臟組織學(xué)變化起到降低損害強度和縮短進(jìn)程的作用。對核因子Egr-1和NF-κB在高峰期或消退期有作用,對趨化因子CINC-1和MIP-2在高峰期或消退期有明顯抑制作用,對粘附分子ICAM-1的表達(dá)有降低作用,對肝組織內(nèi)促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6有一定影響,對肝組織iNOS和NO的表達(dá)有明顯促進(jìn)的作用,對肝組織氧化應(yīng)激的指標(biāo)有明顯恢復(fù)作用。 UDCA在急性淤膽型肝炎時有保護(hù)細(xì)胞膜和促進(jìn)膽汁排泄,改善肝功能的作用,但出現(xiàn)的時間較晚,對急性淤膽型肝炎動物模型的生存狀況也有明顯改善,對肝臟組織學(xué)變化起到降低損害強度和延緩損害進(jìn)程的作用。對核轉(zhuǎn)錄因子Egr-1無明顯作用,但淤膽后期對NF-κB有一定抑制作用,對趨化因子CINC-1和MIP-2沒有明顯抑制作用,對粘附分子ICAM-1的表達(dá)有一定的降低作用,對肝組織內(nèi)促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6,以及血清TNF-α無明顯作用,僅后期對血清IL-6有一定影響,對肝組織iNOS有輕微的促進(jìn)表達(dá)作用,但不影響肝組織中的NO,對肝組織中中性粒細(xì)胞的聚集無明顯影響,對肝組織中氧化應(yīng)激的指標(biāo)也無明顯影響。 經(jīng)地塞米松處理的淤膽型肝炎大鼠的淤膽指數(shù)和堿性磷酸酶出現(xiàn)降低外,其他指標(biāo)如轉(zhuǎn)氨酶,γ-谷氨�；D(zhuǎn)移酶和總膽汁酸均上升,說明地塞米松導(dǎo)致的免疫抑制可能造成肝細(xì)胞的繼發(fā)性損傷。并且,地塞米松處理的大鼠生活質(zhì)量明顯變差,體重急劇下降,凝血功能失常,出現(xiàn)出血傾向,肝組織病理學(xué)改變明顯加重,對核因子Egr-1無影響,早期可以抑制NF-κB,中后期反而加重,甚至還有加強趨化因子CINC-1和MIP-2的作用,對粘附分子ICAM-1的表達(dá)也是早期抑制,中后期反而促進(jìn),對iNOS和NO在上升期和消退期有一定作用,有阻止組織和血清TNF-α和血清IL-6達(dá)到高峰并促進(jìn)恢復(fù)的作用,對MPO反而有促進(jìn)作用,但對氧化產(chǎn)物MDA和抗氧化酶SOD有一定的調(diào)節(jié)作用。 結(jié)論:柯里拉京(corilagin)對淤膽型肝炎的保護(hù)作用上,對肝細(xì)胞膜沒有明顯的保護(hù)作用,但對促進(jìn)膽紅素的排泄,緩解肝臟的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷方面均有不同程度的作用:以促進(jìn)膽紅素排泄,抑制白細(xì)胞向肝臟的募集和趨化,緩解肝臟的氧化應(yīng)激最為明顯,且在整個急性淤膽型肝炎的發(fā)展演變過程中,以發(fā)病的中后期效果最好,起到降低炎癥反應(yīng)的強度和加快炎癥反應(yīng)的過程,促進(jìn)炎癥的恢復(fù)三個方面的作用。UDCA可能是通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞膜上的受體,促進(jìn)膽汁排泄,減輕膽汁酸的損害起到保護(hù)肝臟的作用,其自身對肝臟的炎癥并沒有很明顯的保護(hù)作用。而地塞米松雖然具備一定的退黃作用,但同時也具備加重肝臟損害,促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化和聚集,粘附,導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境紊亂,使病情加重的危險。因此,柯里拉京(corilagin)與UDCA比較,主要體現(xiàn)在通過抑制炎癥和抗氧化達(dá)到護(hù)肝,退黃的作用,并且沒有地塞米松的副作用。
【圖文】：

類植物中藥指紋圖譜監(jiān)控技術(shù)中重點監(jiān)控的成分之一，又名鞣料云實精，化學(xué)名稱為β-1-氧-沒食子酰基-3，6 （R）-六羥基聯(lián)苯-d-葡萄糖（beta-1-O-galloyl-3,6-( R)-hexahydroxy diphenoyl- d-glucose） [圖1]，分子式: C27H22O18分子量: 634.46。近期研究表明，柯里拉京（Corilagin）或含有柯里拉京（Corilagin）的提取物具有多種藥理作用，主要涉及抗氧化，護(hù)肝，抗動脈粥樣硬化，，抗血栓，抗菌，抗腫瘤，降血壓等幾個方面。由于葉下珠是肝病與感染性疾病的常用藥，臨床治療有一定療效，但具體藥理機制目前還不明確。結(jié)合葉下珠的相關(guān)報道，我們推測柯里拉京（Corilagin）可能是葉下珠內(nèi)抗氧化，護(hù)肝作用的主要有效成分之一。因此，我們擬研究柯里拉京（Corilagin）的抗炎

MTT assay of Corilagin on LPS stululated RAW264.7 cell00.10.20.30.40.50.60.70.80.910 320 160 80 40 20 10 5(mg/L)DOvluae圖 1B: 經(jīng) LPS 刺激過的 RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)不同濃度的柯里拉京（corilagin）處理 24小時后所作的 MTT 結(jié)果。數(shù)據(jù)用 mean±SD 表示 (n= 8)。*p<0.05 和經(jīng) LPS 刺激過的RAW264.7 細(xì)胞相比較；**p<0.01 和經(jīng) LPS 刺激過的 RAW264.7 細(xì)胞相比較。** **** **** **
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R575.1

【引證文獻(xiàn)】

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1 羅琳;梁燁瑩;王蓬波;竇志華;張琳;王凱;張偉;;α-萘異硫氰酸酯致小鼠膽汁淤積肝損傷作用的研究[J];毒理學(xué)雜志;2012年05期

本文編號：2638205