【摘要】： 背景自1989年丙型肝炎病毒克隆發(fā)現(xiàn)以來(lái),丙型肝炎病毒的研究一直受制于研究模型的缺乏,利用黑猩猩動(dòng)物模型作為研究手段存在諸多方面的限制,小動(dòng)物模型因丙型肝炎病毒的嚴(yán)格宿主特異性目前不可獲得,因此構(gòu)建一個(gè)簡(jiǎn)單易行的細(xì)胞模型系統(tǒng)對(duì)丙型肝炎病毒的研究無(wú)疑會(huì)起到巨大的推動(dòng)作用。1999年,Lohmann試驗(yàn)小組構(gòu)建成功的亞基因復(fù)制子是丙型肝炎病毒細(xì)胞模型研究的一個(gè)重要里程碑,該系統(tǒng)可以研究丙型肝炎病毒RNA的復(fù)制機(jī)制,但對(duì)于丙型肝炎病毒與細(xì)胞受體之間的關(guān)系研究不能提供幫助,隨后出現(xiàn)的丙型肝炎病毒假病毒顆粒雖部分促進(jìn)了宿主受體探索研究,但始終不能完整模擬丙型肝炎病毒的生活周期。2005年底,美國(guó)四個(gè)實(shí)驗(yàn)小組幾乎同時(shí)報(bào)道了可產(chǎn)生大量有感染性丙型肝炎病毒的細(xì)胞模型系統(tǒng),該系統(tǒng)的構(gòu)建成功得益于一基因型2a的丙型肝炎病毒病毒株的發(fā)現(xiàn)——JFH1,根據(jù)該病毒株的cDNA序列體外構(gòu)建的亞基因復(fù)制子不需引入順應(yīng)性突變即可大量復(fù)制。實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)基因克隆技術(shù)通過(guò)轉(zhuǎn)染該病毒株的RNA或cDNA至易感細(xì)胞,得到具有感染性的丙型肝炎病毒顆粒。此細(xì)胞模型系統(tǒng)可產(chǎn)生大量的具有感染性的丙型肝炎病毒,對(duì)體外研究病毒的組成,生活周期,致病機(jī)制及抗病毒藥物的篩選提供了一個(gè)簡(jiǎn)易有效的平臺(tái)。 目的構(gòu)建可產(chǎn)生有感染性丙型肝炎病毒的細(xì)胞模型,在此模型的基礎(chǔ)上研究丙型肝炎病毒的理化特性,組成成分及干擾素omega抑制丙型肝炎病毒的作用。 方法將利用基因克隆技術(shù)得到的JFH1丙型肝炎病毒全長(zhǎng)RNA通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至Huh7.5細(xì)胞內(nèi),常規(guī)傳代培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,在不同的時(shí)間點(diǎn)留取細(xì)胞培養(yǎng)上清、細(xì)胞總RNA及總蛋白,分別通過(guò)核酶保護(hù)分析法及蛋白印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)丙型肝炎病毒RNA的量及丙型肝炎病毒蛋白的表達(dá)水平,同時(shí)用留取培養(yǎng)上清再感染Huh7.5細(xì)胞,檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清的感染性,證實(shí)該方法可產(chǎn)生有感染性丙型肝炎病毒顆粒。在此模型基礎(chǔ)上獲得大量含感染性丙型肝炎病毒顆粒的上清,經(jīng)濃縮純化后,進(jìn)行蔗糖密度梯度離心,檢測(cè)體外獲得的含丙型肝炎病毒RNA顆粒的顆粒密度,并用蛋白印跡法探討丙型肝炎病毒顆粒的組成成分。同時(shí)利用此模型及丙型肝炎病毒基因型1b的亞基因復(fù)制子系統(tǒng)研究干擾素omega的抗病毒作用,用含不同濃度干擾素omega的培基孵育細(xì)胞3天后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)丙型肝炎病毒RNA及蛋白的水平,以干擾素α-2a為對(duì)照,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)丙型肝炎病毒RNA及蛋白的水平,同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷酸化的STAT1的水平。 結(jié)果通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)可將全長(zhǎng)丙型肝炎病毒RNA轉(zhuǎn)染至易感細(xì)胞內(nèi),經(jīng)培養(yǎng)傳代約2周,轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到丙型肝炎病毒蛋白的表達(dá),轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清再感染易感細(xì)胞,可致被感染細(xì)胞表達(dá)丙型肝炎病毒蛋白及RNA,說(shuō)明轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清含有有感染性的丙型肝炎病毒顆粒,證實(shí)該系統(tǒng)可作為產(chǎn)生有感染性的丙型肝炎病毒的細(xì)胞模型。在此細(xì)胞模型基礎(chǔ)上,我們發(fā)現(xiàn)含丙型肝炎病毒RNA的顆粒密度分布廣泛,在1.08-1.176g/ml之間,而且低密度顆粒的感染性高于高密度顆粒,在含丙型肝炎病毒RNA的顆粒中可以檢測(cè)到apoE蛋白的存在,提示apoE為病毒顆粒的組成成分;同時(shí)在含丙型肝炎病毒RNA的顆粒中,我們同樣可以檢測(cè)到病毒的NS2,NS3,NS4B,NS5A蛋白,這提示上述蛋白亦可能為病毒的組成成分。最后,利用丙型肝炎病毒基因型1b的亞基因復(fù)制子系統(tǒng)及丙型肝炎病毒的細(xì)胞培養(yǎng)模型,我們證實(shí)omega干擾素同樣具有很強(qiáng)的抗病毒作用,兩種干擾素處理后細(xì)胞內(nèi)丙型肝炎病毒的RNA和蛋白的水平較空白對(duì)照組均明顯下降,p＜0.05,且未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性;與相同濃度的干擾素a—2a比較,omega干擾素處理組細(xì)胞內(nèi)蛋白濃度明顯較干擾素a—2a處理組為低,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);而且比較兩種干擾素對(duì)丙型肝炎病毒RNA抑制作用的EC50,omega干擾素的EC50較a—2a干擾素約低10倍。在丙型肝炎病毒的細(xì)胞培養(yǎng)模型基礎(chǔ)上,兩種干擾素處理感染性模型系統(tǒng)后上清感染性均較對(duì)照組減弱,p＜0.05;同樣的,omega干擾素處理組的感染性下降得較a—2a干擾素處理組更為明顯,p＜0.05。兩種干擾素處理后細(xì)胞內(nèi)磷酸化的STAT1的水平均較對(duì)照組為高,p＜0.05;而且omega干擾素處理組較a—2a干擾素處理組升高得更為明顯,p＜0.05。 結(jié)論1.可通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)成功將約10kb的丙型肝炎病毒(JFH1病毒株)全長(zhǎng)RNA轉(zhuǎn)染入Huh7.5細(xì)胞。2.JFH1病毒株病毒RNA轉(zhuǎn)染后可在細(xì)胞中自我復(fù)制、翻譯表達(dá)丙型肝炎病毒特異性蛋白;同時(shí)可獲得有感染性的丙型肝炎病毒顆粒的培養(yǎng)上清。3.體外培養(yǎng)獲得的含丙型肝炎病毒RNA的顆粒以多種密度形式存在,且以低密度為主。低密度病毒顆粒的感染性高于高密度病毒顆粒。4.apoE存在于某些含丙型肝炎病毒RNA的顆粒中,其含量的多少與丙型肝炎病毒顆粒的感染性高低存在良好的正相關(guān)關(guān)系。5.除外結(jié)構(gòu)蛋白,部分傳統(tǒng)意義上的非結(jié)構(gòu)蛋白包括NS2、NS3、NS4B、NS5A亦可在HCV病毒顆粒中檢測(cè)到,其生物學(xué)意義有待進(jìn)一步研究。6.干擾素omega具有抑制丙型肝炎病毒基因型1b及2a病毒復(fù)制的作用,且與干擾素α-2a比較,其抗病毒活性強(qiáng)于干擾素α-2a,原因可能與其激活干擾素受體的能力更強(qiáng)有關(guān)。
【圖文】：

CFig18DeetiontheHCVRNAlevelofHCVeeinfeetedeellstreatedwithIFN.(A)and(B)showedtheRpAresulttreatedwithIFNa一ZaandIFNo.(C)showedthedrug一effeeteurveofIFNbasedonthequantitationofintracellularHCVRNA.圖18RPA檢測(cè)干擾素處理后HCVc。感染細(xì)胞內(nèi)HCV-RNA水平。(A)和(B)分別顯示了RPA檢測(cè)IFNa一2a和IFN。干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)HCvRNA的水平變化。(C)示兩種干擾素對(duì)HCVRNA抑制的藥效曲線。3.IFN。與IFNa一Za的干預(yù)對(duì)培養(yǎng)上清再感染性的影響(1)westemblot檢測(cè)再感染細(xì)胞內(nèi)HCV蛋白的表達(dá)從圖19的A和B可以看出，隨著IFN濃度的升高，NS3的信號(hào)漸減弱，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)NS3蛋白的表達(dá)減少，定量比較蛋白濃度的變化，，IFNa一2a在濃度全4留ml時(shí)，與對(duì)照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.05;IFN。在濃度全0.8川ml時(shí)，與對(duì)照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.05。圖c定量比較相同活性單位的IFN。與IFNa一Za對(duì)蛋白表達(dá)信號(hào)的影響，可以看出相同活性單位下，IFN。干預(yù)

博士學(xué)位論文第三章(2)IFA檢測(cè)再感染細(xì)胞內(nèi)NS3蛋白的表達(dá)圖20直觀的顯示了經(jīng)干擾素處理得到的上清的再感染性變化，紅色HCVNs3蛋白，胞核藍(lán)染，Ns3蛋白的表達(dá)在胞漿，信號(hào)的多少和強(qiáng)弱細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的水平。與westemblot的結(jié)果一致，經(jīng)千擾素處理后細(xì)再感染Huh7.5細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)蛋白信號(hào)減少、減弱，而且，比較相同活性干擾素。和價(jià)Za，前者的抑制強(qiáng)度高于后者。(圖20)下NQZa!FN切
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R512.63

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 魏來(lái);丙型肝炎病毒感染后的自然史[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).流行病學(xué).傳染病學(xué)分冊(cè);1995年04期

2 成軍;丙型肝炎與肝臟脂肪變的相關(guān)性研究的臨床意義[J];臨床肝膽病雜志;2004年04期

3 李軍;田茶;趙玉良;;丙型肝炎病毒感染慢性化的相關(guān)機(jī)制[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2007年02期

4 劉明旭 ,王福生;丙型肝炎病毒受體研究的現(xiàn)狀及展望[J];中華肝臟病雜志;2002年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 丁惠;小干擾RNA在抗HCV感染中的應(yīng)用及HCV包膜蛋白E2誘導(dǎo)小鼠抗體應(yīng)答的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 董秋明;CD81，LDLR單核苷酸多態(tài)性與丙型肝炎病毒感染易感性的相關(guān)性研究[D];蘇州大學(xué);2001年

2 呂麗萍;丙型肝炎病毒感染的小鼠肝癌細(xì)胞模型研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2003年

3 李軍;DC-SIGN介導(dǎo)HCV入胞作用的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2634622