發(fā)布時間：2020-04-20 14:04

【摘要】： 背景自1989年丙型肝炎病毒克隆發(fā)現以來,丙型肝炎病毒的研究一直受制于研究模型的缺乏,利用黑猩猩動物模型作為研究手段存在諸多方面的限制,小動物模型因丙型肝炎病毒的嚴格宿主特異性目前不可獲得,因此構建一個簡單易行的細胞模型系統對丙型肝炎病毒的研究無疑會起到巨大的推動作用。1999年,Lohmann試驗小組構建成功的亞基因復制子是丙型肝炎病毒細胞模型研究的一個重要里程碑,該系統可以研究丙型肝炎病毒RNA的復制機制,但對于丙型肝炎病毒與細胞受體之間的關系研究不能提供幫助,隨后出現的丙型肝炎病毒假病毒顆粒雖部分促進了宿主受體探索研究,但始終不能完整模擬丙型肝炎病毒的生活周期。2005年底,美國四個實驗小組幾乎同時報道了可產生大量有感染性丙型肝炎病毒的細胞模型系統,該系統的構建成功得益于一基因型2a的丙型肝炎病毒病毒株的發(fā)現——JFH1,根據該病毒株的cDNA序列體外構建的亞基因復制子不需引入順應性突變即可大量復制。實驗人員通過基因克隆技術通過轉染該病毒株的RNA或cDNA至易感細胞,得到具有感染性的丙型肝炎病毒顆粒。此細胞模型系統可產生大量的具有感染性的丙型肝炎病毒,對體外研究病毒的組成,生活周期,致病機制及抗病毒藥物的篩選提供了一個簡易有效的平臺。 目的構建可產生有感染性丙型肝炎病毒的細胞模型,在此模型的基礎上研究丙型肝炎病毒的理化特性,組成成分及干擾素omega抑制丙型肝炎病毒的作用。 方法將利用基因克隆技術得到的JFH1丙型肝炎病毒全長RNA通過脂質體轉染至Huh7.5細胞內,常規(guī)傳代培養(yǎng)轉染細胞,在不同的時間點留取細胞培養(yǎng)上清、細胞總RNA及總蛋白,分別通過核酶保護分析法及蛋白印跡法檢測轉染后不同時間點轉染細胞內丙型肝炎病毒RNA的量及丙型肝炎病毒蛋白的表達水平,同時用留取培養(yǎng)上清再感染Huh7.5細胞,檢測轉染細胞上清的感染性,證實該方法可產生有感染性丙型肝炎病毒顆粒。在此模型基礎上獲得大量含感染性丙型肝炎病毒顆粒的上清,經濃縮純化后,進行蔗糖密度梯度離心,檢測體外獲得的含丙型肝炎病毒RNA顆粒的顆粒密度,并用蛋白印跡法探討丙型肝炎病毒顆粒的組成成分。同時利用此模型及丙型肝炎病毒基因型1b的亞基因復制子系統研究干擾素omega的抗病毒作用,用含不同濃度干擾素omega的培基孵育細胞3天后檢測細胞內丙型肝炎病毒RNA及蛋白的水平,以干擾素α-2a為對照,檢測細胞內丙型肝炎病毒RNA及蛋白的水平,同時檢測細胞內磷酸化的STAT1的水平。 結果通過脂質體轉染技術可將全長丙型肝炎病毒RNA轉染至易感細胞內,經培養(yǎng)傳代約2周,轉染細胞內可檢測到丙型肝炎病毒蛋白的表達,轉染細胞上清再感染易感細胞,可致被感染細胞表達丙型肝炎病毒蛋白及RNA,說明轉染細胞上清含有有感染性的丙型肝炎病毒顆粒,證實該系統可作為產生有感染性的丙型肝炎病毒的細胞模型。在此細胞模型基礎上,我們發(fā)現含丙型肝炎病毒RNA的顆粒密度分布廣泛,在1.08-1.176g/ml之間,而且低密度顆粒的感染性高于高密度顆粒,在含丙型肝炎病毒RNA的顆粒中可以檢測到apoE蛋白的存在,提示apoE為病毒顆粒的組成成分;同時在含丙型肝炎病毒RNA的顆粒中,我們同樣可以檢測到病毒的NS2,NS3,NS4B,NS5A蛋白,這提示上述蛋白亦可能為病毒的組成成分。最后,利用丙型肝炎病毒基因型1b的亞基因復制子系統及丙型肝炎病毒的細胞培養(yǎng)模型,我們證實omega干擾素同樣具有很強的抗病毒作用,兩種干擾素處理后細胞內丙型肝炎病毒的RNA和蛋白的水平較空白對照組均明顯下降,p＜0.05,且未發(fā)現細胞毒性;與相同濃度的干擾素a—2a比較,omega干擾素處理組細胞內蛋白濃度明顯較干擾素a—2a處理組為低,其差異具有統計學意義(p＜0.05);而且比較兩種干擾素對丙型肝炎病毒RNA抑制作用的EC50,omega干擾素的EC50較a—2a干擾素約低10倍。在丙型肝炎病毒的細胞培養(yǎng)模型基礎上,兩種干擾素處理感染性模型系統后上清感染性均較對照組減弱,p＜0.05;同樣的,omega干擾素處理組的感染性下降得較a—2a干擾素處理組更為明顯,p＜0.05。兩種干擾素處理后細胞內磷酸化的STAT1的水平均較對照組為高,p＜0.05;而且omega干擾素處理組較a—2a干擾素處理組升高得更為明顯,p＜0.05。 結論1.可通過脂質體轉染技術成功將約10kb的丙型肝炎病毒(JFH1病毒株)全長RNA轉染入Huh7.5細胞。2.JFH1病毒株病毒RNA轉染后可在細胞中自我復制、翻譯表達丙型肝炎病毒特異性蛋白;同時可獲得有感染性的丙型肝炎病毒顆粒的培養(yǎng)上清。3.體外培養(yǎng)獲得的含丙型肝炎病毒RNA的顆粒以多種密度形式存在,且以低密度為主。低密度病毒顆粒的感染性高于高密度病毒顆粒。4.apoE存在于某些含丙型肝炎病毒RNA的顆粒中,其含量的多少與丙型肝炎病毒顆粒的感染性高低存在良好的正相關關系。5.除外結構蛋白,部分傳統意義上的非結構蛋白包括NS2、NS3、NS4B、NS5A亦可在HCV病毒顆粒中檢測到,其生物學意義有待進一步研究。6.干擾素omega具有抑制丙型肝炎病毒基因型1b及2a病毒復制的作用,且與干擾素α-2a比較,其抗病毒活性強于干擾素α-2a,原因可能與其激活干擾素受體的能力更強有關。
【圖文】：

CFig18DeetiontheHCVRNAlevelofHCVeeinfeetedeellstreatedwithIFN.(A)and(B)showedtheRpAresulttreatedwithIFNa一ZaandIFNo.(C)showedthedrug一effeeteurveofIFNbasedonthequantitationofintracellularHCVRNA.圖18RPA檢測干擾素處理后HCVc。感染細胞內HCV-RNA水平。(A)和(B)分別顯示了RPA檢測IFNa一2a和IFN。干預后細胞內HCvRNA的水平變化。(C)示兩種干擾素對HCVRNA抑制的藥效曲線。3.IFN。與IFNa一Za的干預對培養(yǎng)上清再感染性的影響(1)westemblot檢測再感染細胞內HCV蛋白的表達從圖19的A和B可以看出，隨著IFN濃度的升高，NS3的信號漸減弱，說明細胞內NS3蛋白的表達減少，定量比較蛋白濃度的變化，，IFNa一2a在濃度全4留ml時，與對照組之間的差異具有統計學意義，p<0.05;IFN。在濃度全0.8川ml時，與對照組之間的差異具有統計學意義，p<0.05。圖c定量比較相同活性單位的IFN。與IFNa一Za對蛋白表達信號的影響，可以看出相同活性單位下，IFN。干預

博士學位論文第三章(2)IFA檢測再感染細胞內NS3蛋白的表達圖20直觀的顯示了經干擾素處理得到的上清的再感染性變化，紅色HCVNs3蛋白，胞核藍染，Ns3蛋白的表達在胞漿，信號的多少和強弱細胞內蛋白表達的水平。與westemblot的結果一致，經千擾素處理后細再感染Huh7.5細胞，細胞內蛋白信號減少、減弱，而且，比較相同活性干擾素。和價Za，前者的抑制強度高于后者。(圖20)下NQZa!FN切
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R512.63

【共引文獻】

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3 李軍;田茶;趙玉良;;丙型肝炎病毒感染慢性化的相關機制[J];現代預防醫(yī)學;2007年02期

4 劉明旭 ,王福生;丙型肝炎病毒受體研究的現狀及展望[J];中華肝臟病雜志;2002年04期

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2 呂麗萍;丙型肝炎病毒感染的小鼠肝癌細胞模型研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2003年

3 李軍;DC-SIGN介導HCV入胞作用的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2006年

本文編號：2634622