【摘要】：研究背景 丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)是一種主要經(jīng)過(guò)血液傳播的嗜肝性病毒,其慢性感染可引起慢性丙型肝炎,進(jìn)而可導(dǎo)致肝硬化或肝細(xì)胞癌。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),全球丙型肝炎病毒(HCV)感染者約1.7億(感染率約為3%),我國(guó)HCV感染率為3.2%,且感染率仍有逐年上升的趨勢(shì)。然而HCV感染治療的手段有限,主要依靠α-干擾素,及以α-干擾素為主體再附加其他輔助手段。目前也還沒(méi)有有效疫苗,使得HCV感染成為一個(gè)重要的社會(huì)問(wèn)題。盡管科學(xué)研究受到廣泛的重視,但HCV感染的分子機(jī)制還有許多不清楚,從而影響了臨床丙肝病毒感染的治療手段的發(fā)展。 HCV屬黃病毒科丙型肝炎病毒屬。HCV編碼多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白,其中NS5A是一個(gè)重要的非結(jié)構(gòu)蛋白。它有兩種磷酸化形式：p56和p58,它們均可以與宿主內(nèi)多種信號(hào)蛋白發(fā)生作用。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)NS5A與胰島素信號(hào)通路(Insulin/PI3K/Akt通路)之間存在關(guān)聯(lián)。而胰島素信號(hào)通路在細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。這意味著NS5A可能通過(guò)改變胰島素信號(hào)通路,從而在HCV感染過(guò)程中發(fā)揮其作用。在正常情況下這條信號(hào)通路受到嚴(yán)格的調(diào)控,其穩(wěn)態(tài)的變化與不同疾病的發(fā)生相聯(lián)系。當(dāng)Insulin/PI3K/Akt信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子PI3K(調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110)、Akt等編碼基因的功能發(fā)生改變,可導(dǎo)致細(xì)胞代謝障礙、細(xì)胞周期及細(xì)胞生長(zhǎng)凋亡紊亂而引起各種疾病,例如腫瘤。HCV蛋白NS5A可結(jié)合并激活PI3K,導(dǎo)致下游分子絲氨酸/蘇氨酸激酶,即Akt/蛋白激酶B的激活,破壞了信號(hào)通路在體內(nèi)的穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致HCV感染的細(xì)胞持續(xù)增殖而引發(fā)一系列病理效應(yīng),包括抗病毒抗性的產(chǎn)生[4-5]、肝細(xì)胞癌發(fā)生等[6-7]。 PTEN是除p53之后一個(gè)重要的抑癌基因。該基因功能的降低與多種組織的腫瘤發(fā)生有關(guān)。曾有研究報(bào)道丙肝導(dǎo)致的肝癌中,PTEN的功能降低。而PTEN是胰島素信號(hào)的主要負(fù)調(diào)節(jié)因了,抑制Insulin/PI3K/Akt信號(hào),從而與HCV激活I(lǐng)nsulin/PI3K/Akt信號(hào)作用相對(duì)抗。本論文研究了抑癌基因PTEN與細(xì)胞胰島素信號(hào)通路穩(wěn)態(tài)的關(guān)系,及HCV蛋白NS5A對(duì)細(xì)胞胰島素信號(hào)通路穩(wěn)態(tài)的破壞作用,顯示了PTEN與NS5A從正反兩個(gè)方面影響胰島素信號(hào)通路,通過(guò)改變?cè)撔盘?hào)通路的穩(wěn)態(tài),從而影響細(xì)胞的命運(yùn)。 第一部分PTEN對(duì)Insulin/PI3K/Akt信號(hào)通路穩(wěn)態(tài)的作用 [目的] 既然,丙肝肝癌中,PTEN的功能減弱。因此,我們首先研究PTEN與Insulin/PI3K/Akt穩(wěn)態(tài)的關(guān)系。我們以人肝癌細(xì)胞系HepG2為研究模型,用胰島素刺激、或上調(diào)或沉默PTEN的表達(dá)等,利用Western blot技術(shù),從蛋白水平層面研究Insulin/PI3K/Akt信號(hào)通路的穩(wěn)態(tài)變化。 [方法] 1、常規(guī)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞傳代均勻鋪十二孔板,待長(zhǎng)至約90%后,予血清饑餓24小時(shí)后裂解細(xì)胞。裂解細(xì)胞前予insulin刺激10min(胰島素工作濃度為2ul/ml,用無(wú)血清DMEM液稀釋)或加入同體積的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液作對(duì)照,分為insulin刺激組或control組,裂解細(xì)胞提取總蛋白,Western blot蛋白分析法檢測(cè)p-Akt蛋白表達(dá)水平。 2、常規(guī)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞根據(jù)轉(zhuǎn)染攜帶人野生型PTEN的真核表達(dá)質(zhì)粒(pSvEGFP-PTEN)或磷酸酶域突變型質(zhì)粒pSvEGFP-C124S兩種不同質(zhì)粒分為兩組,即PTEN wt組及PTENC124S組,轉(zhuǎn)染、血清饑餓同上。兩組均予等量等濃度胰島素刺激10min后裂解細(xì)胞,提取總蛋白。Western blot蛋白分析檢測(cè)p-Akt蛋白表達(dá)水平。 3、常規(guī)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞根據(jù)轉(zhuǎn)染PTEN siRNA及其control siRNA分為兩組,即PTEN siRNA組及control組,轉(zhuǎn)染、血清饑餓及胰島素刺激同上。轉(zhuǎn)染共48小時(shí)后常規(guī)裂解細(xì)胞,提取總蛋白。Western blot蛋白分析法檢測(cè)PTEN及p-Akt兩種蛋白表達(dá)水平。 4、所有結(jié)果經(jīng)Excel2010及SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,數(shù)據(jù)以“算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(M±S.E.M)”表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-Samples T Test)或兩個(gè)獨(dú)立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗(yàn),以P值0.05視為有顯著性差異。 [結(jié)果] 1、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示insulin刺激組較control組p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著提高(P0.010), Western blot以β-actin作內(nèi)參,兩組灰度比值比分別為0.221±0.136及0.000+0.000。 2、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示PTENC124S組較PTEN wt組Akt磷酸化水平有所提高(灰度比值比分別為0.360±0.141和0.084±0.055,P0.05)。 3、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示PTEN siRNA組比control組HepG2細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)水平偏低(P0.05),相應(yīng)的p-Akt蛋白表達(dá)水平卻相對(duì)顯著提高(P0.005)。 [結(jié)論] 1、胰島素可以誘導(dǎo)Insulin/PI3K/Akt信號(hào)通路的激活。 2、當(dāng)Insulin/PI3K/Akt信號(hào)通路中某一環(huán)節(jié)如負(fù)調(diào)控因子PTEN基因點(diǎn)突變或敲低,可引起下游信號(hào)分子Akt活化。 3、在正常情況下Insulin/PI3K/Akt信號(hào)通路受到嚴(yán)格的調(diào)控,外源性干預(yù)使信號(hào)通路中任一環(huán)節(jié)受阻或失控,這一穩(wěn)態(tài)將被打破,或過(guò)度抑制或過(guò)度激活。 第二部分HCV蛋白NS5A在Insulin/PI3K/Akt信號(hào)通路中的作用 [目的] 上一部分顯示,PTEN對(duì)Insulin/PI3K/Akt穩(wěn)態(tài)的作用。接著,我們研究NS5A對(duì)Insulin/PI3K/Akt的影響。我們將丙肝病毒NS5A質(zhì)粒導(dǎo)入Insulin/PI3K/Akt信號(hào)通路活躍的人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中,從蛋白水平探求丙肝病毒(HCV)蛋白NS5A對(duì)于PI3K/Akt通路的調(diào)控作用及其初步機(jī)制,為臨床上丙肝慢性遷延、肝細(xì)胞癌發(fā)生及抗病毒抗性等方面提供依據(jù)。 [方法l 1、HepG2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染NS5A質(zhì)粒或?qū)φ湛蛰d體,轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒24小時(shí)后血清饑餓。轉(zhuǎn)染共48小時(shí)后胰島素刺激10min即常規(guī)裂解細(xì)胞提取總蛋白。以p-Akt抗體為一抗,Western blot檢測(cè)Akt磷酸化水平。 2、常規(guī)培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞根據(jù)轉(zhuǎn)染NS5A質(zhì)粒或?qū)φ湛蛰d體兩組不同質(zhì)粒分為NS5A組及control組,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后常規(guī)裂解細(xì)胞提取總蛋白。采用免疫沉淀法檢測(cè)：將NS5A組或control組HepG2細(xì)胞總蛋白先與PI3K調(diào)節(jié)亞基p85多克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀,再以anti-pTyr為Western blot抗體檢測(cè),比較兩組間p85酪氨酸磷酸化水平。 3、常規(guī)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞根據(jù)轉(zhuǎn)染NS5A質(zhì)粒或?qū)φ湛蛰d體兩組不同質(zhì)粒分為NS5A組及control組,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后常規(guī)裂解細(xì)胞提取總蛋白。采免疫共沉淀法檢測(cè)：將NS5A組或control組HepG2細(xì)胞總蛋白先與PI3K催化亞基p85多克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀,再以anti-p110為Western blot抗體檢測(cè),比較兩組間催化亞基p110與調(diào)節(jié)亞基p85的結(jié)合水平。 4、所有結(jié)果經(jīng)Excel2010及SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,數(shù)據(jù)以“算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(M±S.E.M)”表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-Samples T Test)或兩個(gè)獨(dú)立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗(yàn),以P值0.05視為有顯著性差異。 [結(jié)果] 1、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示NS5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞p-Akt蛋白水平較control組明顯上調(diào)(灰度比值比分別為0.811±0.131及0.205+0.066,P0.002)。 2、免疫沉淀法檢測(cè)到NS5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的p85酪氨酸磷酸化水平較control組的高(灰度比值比分別為1.055+0.189及0.479+0.147,0.014)。 3、免疫共沉淀法檢測(cè)結(jié)果顯示NS5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與control組細(xì)胞的p85和p110蛋白結(jié)合無(wú)差異(灰度比值比分別為0.543+0.286及0.195,P0.05)。 [結(jié)論] HCV蛋白NS5A可以與PI3K調(diào)節(jié)亞基p85蛋白相互作用,進(jìn)而激活I(lǐng)nsulin/PI3K/Akt信號(hào)通路,但HCV蛋白NS5A與p85蛋白間的相互作用并沒(méi)有影響到PI3K調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110間的結(jié)合。HCV蛋白NS5A激活P13K信號(hào)通路,可能不是通過(guò)經(jīng)典途徑發(fā)生,而是通過(guò)其他途徑。這可能提示著,HCV對(duì)胰島素信號(hào)通路的影響的另一機(jī)制,正是通過(guò)影響PTEN的途徑。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R512.6

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本文編號(hào)：2634582