【摘要】：研究背景 丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)是一種主要經(jīng)過血液傳播的嗜肝性病毒,其慢性感染可引起慢性丙型肝炎,進而可導致肝硬化或肝細胞癌。據(jù)WHO統(tǒng)計,全球丙型肝炎病毒(HCV)感染者約1.7億(感染率約為3%),我國HCV感染率為3.2%,且感染率仍有逐年上升的趨勢。然而HCV感染治療的手段有限,主要依靠α-干擾素,及以α-干擾素為主體再附加其他輔助手段。目前也還沒有有效疫苗,使得HCV感染成為一個重要的社會問題。盡管科學研究受到廣泛的重視,但HCV感染的分子機制還有許多不清楚,從而影響了臨床丙肝病毒感染的治療手段的發(fā)展。 HCV屬黃病毒科丙型肝炎病毒屬。HCV編碼多個結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白,其中NS5A是一個重要的非結(jié)構(gòu)蛋白。它有兩種磷酸化形式：p56和p58,它們均可以與宿主內(nèi)多種信號蛋白發(fā)生作用。近來的研究發(fā)現(xiàn)NS5A與胰島素信號通路(Insulin/PI3K/Akt通路)之間存在關聯(lián)。而胰島素信號通路在細胞代謝、細胞周期調(diào)控、細胞生長凋亡等多種生物學過程中發(fā)揮著重要的作用。這意味著NS5A可能通過改變胰島素信號通路,從而在HCV感染過程中發(fā)揮其作用。在正常情況下這條信號通路受到嚴格的調(diào)控,其穩(wěn)態(tài)的變化與不同疾病的發(fā)生相聯(lián)系。當Insulin/PI3K/Akt信號通路中的關鍵分子PI3K(調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110)、Akt等編碼基因的功能發(fā)生改變,可導致細胞代謝障礙、細胞周期及細胞生長凋亡紊亂而引起各種疾病,例如腫瘤。HCV蛋白NS5A可結(jié)合并激活PI3K,導致下游分子絲氨酸/蘇氨酸激酶,即Akt/蛋白激酶B的激活,破壞了信號通路在體內(nèi)的穩(wěn)態(tài),導致HCV感染的細胞持續(xù)增殖而引發(fā)一系列病理效應,包括抗病毒抗性的產(chǎn)生[4-5]、肝細胞癌發(fā)生等[6-7]。 PTEN是除p53之后一個重要的抑癌基因。該基因功能的降低與多種組織的腫瘤發(fā)生有關。曾有研究報道丙肝導致的肝癌中,PTEN的功能降低。而PTEN是胰島素信號的主要負調(diào)節(jié)因了,抑制Insulin/PI3K/Akt信號,從而與HCV激活Insulin/PI3K/Akt信號作用相對抗。本論文研究了抑癌基因PTEN與細胞胰島素信號通路穩(wěn)態(tài)的關系,及HCV蛋白NS5A對細胞胰島素信號通路穩(wěn)態(tài)的破壞作用,顯示了PTEN與NS5A從正反兩個方面影響胰島素信號通路,通過改變該信號通路的穩(wěn)態(tài),從而影響細胞的命運。 第一部分PTEN對Insulin/PI3K/Akt信號通路穩(wěn)態(tài)的作用 [目的] 既然,丙肝肝癌中,PTEN的功能減弱。因此,我們首先研究PTEN與Insulin/PI3K/Akt穩(wěn)態(tài)的關系。我們以人肝癌細胞系HepG2為研究模型,用胰島素刺激、或上調(diào)或沉默PTEN的表達等,利用Western blot技術,從蛋白水平層面研究Insulin/PI3K/Akt信號通路的穩(wěn)態(tài)變化。 [方法] 1、常規(guī)培養(yǎng)HepG2細胞傳代均勻鋪十二孔板,待長至約90%后,予血清饑餓24小時后裂解細胞。裂解細胞前予insulin刺激10min(胰島素工作濃度為2ul/ml,用無血清DMEM液稀釋)或加入同體積的無血清DMEM培養(yǎng)液作對照,分為insulin刺激組或control組,裂解細胞提取總蛋白,Western blot蛋白分析法檢測p-Akt蛋白表達水平。 2、常規(guī)培養(yǎng)的HepG2細胞根據(jù)轉(zhuǎn)染攜帶人野生型PTEN的真核表達質(zhì)粒(pSvEGFP-PTEN)或磷酸酶域突變型質(zhì)粒pSvEGFP-C124S兩種不同質(zhì)粒分為兩組,即PTEN wt組及PTENC124S組,轉(zhuǎn)染、血清饑餓同上。兩組均予等量等濃度胰島素刺激10min后裂解細胞,提取總蛋白。Western blot蛋白分析檢測p-Akt蛋白表達水平。 3、常規(guī)培養(yǎng)的HepG2細胞根據(jù)轉(zhuǎn)染PTEN siRNA及其control siRNA分為兩組,即PTEN siRNA組及control組,轉(zhuǎn)染、血清饑餓及胰島素刺激同上。轉(zhuǎn)染共48小時后常規(guī)裂解細胞,提取總蛋白。Western blot蛋白分析法檢測PTEN及p-Akt兩種蛋白表達水平。 4、所有結(jié)果經(jīng)Excel2010及SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,數(shù)據(jù)以“算術平均值±標準誤(M±S.E.M)”表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗(Independent-Samples T Test)或兩個獨立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗,以P值0.05視為有顯著性差異。 [結(jié)果] 1、Western blot檢測結(jié)果顯示insulin刺激組較control組p-Akt蛋白表達水平顯著提高(P0.010), Western blot以β-actin作內(nèi)參,兩組灰度比值比分別為0.221±0.136及0.000+0.000。 2、Western blot檢測結(jié)果顯示PTENC124S組較PTEN wt組Akt磷酸化水平有所提高(灰度比值比分別為0.360±0.141和0.084±0.055,P0.05)。 3、Western blot檢測結(jié)果顯示PTEN siRNA組比control組HepG2細胞PTEN蛋白表達水平偏低(P0.05),相應的p-Akt蛋白表達水平卻相對顯著提高(P0.005)。 [結(jié)論] 1、胰島素可以誘導Insulin/PI3K/Akt信號通路的激活。 2、當Insulin/PI3K/Akt信號通路中某一環(huán)節(jié)如負調(diào)控因子PTEN基因點突變或敲低,可引起下游信號分子Akt活化。 3、在正常情況下Insulin/PI3K/Akt信號通路受到嚴格的調(diào)控,外源性干預使信號通路中任一環(huán)節(jié)受阻或失控,這一穩(wěn)態(tài)將被打破,或過度抑制或過度激活。 第二部分HCV蛋白NS5A在Insulin/PI3K/Akt信號通路中的作用 [目的] 上一部分顯示,PTEN對Insulin/PI3K/Akt穩(wěn)態(tài)的作用。接著,我們研究NS5A對Insulin/PI3K/Akt的影響。我們將丙肝病毒NS5A質(zhì)粒導入Insulin/PI3K/Akt信號通路活躍的人肝癌細胞系HepG2細胞中,從蛋白水平探求丙肝病毒(HCV)蛋白NS5A對于PI3K/Akt通路的調(diào)控作用及其初步機制,為臨床上丙肝慢性遷延、肝細胞癌發(fā)生及抗病毒抗性等方面提供依據(jù)。 [方法l 1、HepG2細胞分別轉(zhuǎn)染NS5A質(zhì)�；�?qū)φ湛蛰d體,轉(zhuǎn)染相應質(zhì)粒24小時后血清饑餓。轉(zhuǎn)染共48小時后胰島素刺激10min即常規(guī)裂解細胞提取總蛋白。以p-Akt抗體為一抗,Western blot檢測Akt磷酸化水平。 2、常規(guī)培養(yǎng)的HepG2細胞根據(jù)轉(zhuǎn)染NS5A質(zhì)�；�?qū)φ湛蛰d體兩組不同質(zhì)粒分為NS5A組及control組,轉(zhuǎn)染48小時后常規(guī)裂解細胞提取總蛋白。采用免疫沉淀法檢測：將NS5A組或control組HepG2細胞總蛋白先與PI3K調(diào)節(jié)亞基p85多克隆抗體進行免疫沉淀,再以anti-pTyr為Western blot抗體檢測,比較兩組間p85酪氨酸磷酸化水平。 3、常規(guī)培養(yǎng)HepG2細胞根據(jù)轉(zhuǎn)染NS5A質(zhì)�；�?qū)φ湛蛰d體兩組不同質(zhì)粒分為NS5A組及control組,轉(zhuǎn)染48小時后常規(guī)裂解細胞提取總蛋白。采免疫共沉淀法檢測：將NS5A組或control組HepG2細胞總蛋白先與PI3K催化亞基p85多克隆抗體進行免疫沉淀,再以anti-p110為Western blot抗體檢測,比較兩組間催化亞基p110與調(diào)節(jié)亞基p85的結(jié)合水平。 4、所有結(jié)果經(jīng)Excel2010及SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,數(shù)據(jù)以“算術平均值±標準誤(M±S.E.M)”表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗(Independent-Samples T Test)或兩個獨立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗,以P值0.05視為有顯著性差異。 [結(jié)果] 1、Western blot檢測結(jié)果顯示NS5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HepG2細胞p-Akt蛋白水平較control組明顯上調(diào)(灰度比值比分別為0.811±0.131及0.205+0.066,P0.002)。 2、免疫沉淀法檢測到NS5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的p85酪氨酸磷酸化水平較control組的高(灰度比值比分別為1.055+0.189及0.479+0.147,0.014)。 3、免疫共沉淀法檢測結(jié)果顯示NS5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與control組細胞的p85和p110蛋白結(jié)合無差異(灰度比值比分別為0.543+0.286及0.195,P0.05)。 [結(jié)論] HCV蛋白NS5A可以與PI3K調(diào)節(jié)亞基p85蛋白相互作用,進而激活Insulin/PI3K/Akt信號通路,但HCV蛋白NS5A與p85蛋白間的相互作用并沒有影響到PI3K調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110間的結(jié)合。HCV蛋白NS5A激活P13K信號通路,可能不是通過經(jīng)典途徑發(fā)生,而是通過其他途徑。這可能提示著,HCV對胰島素信號通路的影響的另一機制,正是通過影響PTEN的途徑。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R512.6

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本文編號：2634582