【摘要】：研究目的:急性胰腺炎(AP)是常見的腹部炎性疾病之一,由于胰腺內(nèi)的胰酶被激活,引起胰腺自身消化、水腫、壞死,可呈自限性。但嚴(yán)重時(shí)引起全身性炎癥反應(yīng)和多器官衰竭。細(xì)胞分裂周期蛋白42(Cdc42)是Ras超家族,Rho蛋白家族的小GTP酶,與GTP或GDP結(jié)合時(shí)分別處于激活態(tài)、失活態(tài)。激活態(tài)的Cdc42與不同種類的靶蛋白結(jié)合,行使多種調(diào)控功能,如細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移、上皮細(xì)胞極化等。本文利用巨噬細(xì)胞特異性缺失Cdc42基因的小鼠(Cdc42-Lyz2cre)探討巨噬細(xì)胞中Cdc42基因?qū)毙砸认傺椎挠绊懞妥饔脵C(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:1.選取8-12周齡巨噬細(xì)胞特異性敲除Cdc42(F/F+)和不帶Cre的Cdc42~(flox/flox)小鼠(F/F-),分成雨蛙素實(shí)驗(yàn)組(或?qū)嶒?yàn)組)和對(duì)照組。2.動(dòng)物水平:實(shí)驗(yàn)組(含F(xiàn)/F+和F/F-小鼠)采用膽囊收縮素類似物━━雨蛙素,用PBS或生理鹽水配制原液200 ug/ml(20X),以每小時(shí)為間隔,進(jìn)行8次腹腔注射給藥(50ug/5ml/kg)誘導(dǎo)AP;對(duì)照組給予PBS或生理鹽水,在誘導(dǎo)后的1h、8h、14h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別收集全血、血清、胰腺、肺和脾臟。HE染色和免疫組化染色用以觀察組織損傷和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況;檢測(cè)血清中淀粉酶、脂肪酶、單核細(xì)胞趨化因子MCP-1(又名CCL2)和炎性因子IL-6、TNF-α的濃度;血常規(guī)分析全血中白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞(neutrophil)、血小板(thrombocyte)和淋巴細(xì)胞(Lymph)的數(shù)量變化。3.細(xì)胞水平:分別收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,RT-q PCR檢測(cè)炎癥因子表達(dá);體外培養(yǎng)F/F+和F/F-小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞或Raw264.7巨噬細(xì)胞,后者給予Cdc42的活性抑制劑ML141,抑制其活性2h后,兩者均給予0,10,100,1000ng/ml LPS,分別刺激24h和6h。Western blot檢測(cè)比較Cdc42對(duì)巨噬細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.在實(shí)驗(yàn)組中,F/F+小鼠血清中淀粉酶水平更高,且血清中IL-6和TNF-α的濃度也明顯高于F/F-小鼠。巨噬細(xì)胞特異性敲除Cdc42會(huì)顯著加重小鼠急性胰腺炎;2.在實(shí)驗(yàn)組中,F/F+小鼠的胰腺中CD11b+表達(dá)的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量明顯增多,F/F+組肺部中性粒細(xì)胞明顯增加(AP相關(guān)的肺組織損傷),但血清脂肪酶和趨化因子MCP-1水平無差異;3.小鼠血常規(guī)結(jié)果顯示全血中白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量在造模后1h明顯減少,中性粒細(xì)胞則明顯增多,血小板數(shù)量表現(xiàn)為增多的情況,隨著時(shí)間的推移會(huì)逐漸恢復(fù)正常水平,兩組間無明顯差異。4.F/F+1h實(shí)驗(yàn)組腹腔巨噬細(xì)胞IL-6、IL-1β和TNF-α的m RNA表達(dá)量顯著高于F/F-實(shí)驗(yàn)組。5.ML141抑制RAW246.7細(xì)胞Cdc42活性后,再給予LPS,CCR2蛋白表達(dá)量明顯增加,AMPK、NF-κB、ERK的蛋白磷酸化表達(dá)明顯增加;LPS條件下敲除Cdc42的腹腔巨噬細(xì)胞,其CCR2的蛋白表達(dá)量也明顯增加,AMPK、NF-κB、ERK的蛋白磷酸化表達(dá)明顯增加。結(jié)論:小鼠巨噬細(xì)胞Cdc42特異性敲除加重小鼠雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎。本研究顯示Cdc42缺失促進(jìn)了巨噬細(xì)胞在炎性因素誘導(dǎo)下對(duì)IL-6、TNF-α和IL-1β的轉(zhuǎn)錄合成,并通過增加巨噬細(xì)胞CCR2的表達(dá),增加急性胰腺炎時(shí)胰腺組織中CD11b陽(yáng)性巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)加重胰腺損傷。
【圖文】：

Cdc42-Lyzcre小鼠雜交制備方法

圖 2.2 Cdc42-LyzCre 小鼠基因型鑒定2.3.2 檢測(cè)骨髓細(xì)胞中 Cdc42 蛋白水平實(shí)驗(yàn)室前期在已提取的腹腔巨噬細(xì)胞水平驗(yàn)證過小鼠 Cdc42 敲除情況，本實(shí)驗(yàn)分離并提取小鼠的骨髓細(xì)胞蛋白，采用 Western blot 檢測(cè)骨髓細(xì)胞水平Cdc42 的敲除情況和 Cre 的表達(dá)情況，并以內(nèi)參 β-actin 為對(duì)照進(jìn)行灰度值分析。F/F+組 Cdc42 的蛋白表達(dá)量較 F/F-組而言，降低十分明顯，，約為 F/F-組的 30%（P<0.05）。F/F+組 Cre 的蛋白條帶明亮清晰。表明由骨髓發(fā)育而來的巨噬細(xì)胞中特異性敲除 Cdc42 小鼠可用。具體見下圖 2.3。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R576

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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2 Karolina Akinosoglou;Charalambos Gogos;;Immune-modulating therapy in acute pancreatitis:Fact or fiction[J];World Journal of Gastroenterology;2014年41期

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本文編號(hào)：2634524