【摘要】：目的:觀察MT2缺失在四氯化碳致小鼠肝臟功能損傷及肝纖維化中的作用,探討MT2抗肝纖維化效應及可能機制,為臨床防治創(chuàng)傷、慢性炎癥引起的肝功能異常和肝纖維化提供實驗依據(jù)。方法:1.動物模型的制備和分組取健康SPF級(18-22g)雄性C57BL野生型小鼠12只及應用CRISPR/Cas9敲除MT2構建MT2低表達組小鼠12只,隨機分為4組:正常對照組(WT)(6只),MT2低表達對照組(MT-KO)(6只),野生型四氯化碳組(WT-CCl_4)(6只),MT2低表達四氯化碳組(MT-K0-CCl_4)(6只)。實驗組均通過反復腹腔注射橄欖油稀釋的四氯化碳溶液4周(四氯化碳和橄欖油以1:4體積比混勻,5ml/kg,每周兩次)誘導肝纖維化,建立肝纖維化模型。對照組注射等體積橄欖油。第4周末稱重后用4%水合氯醛(0.15mL/20g)腹腔注射麻醉后心臟取血收集血清和肝臟標本,-80℃保存,備用。2.血清學指標檢查檢測各組小鼠肝功能和相關炎癥因子血清水平:丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)和總膽紅素(TB)含量,ELISA檢測血清中IL-6、TNF-α指標變化。3.組織標本的病理學檢查HE、Masson和天狼星紅染色觀察肝組織病理及纖維化改變,Western Blot檢測肝臟組織中α-SAM。4.肝臟組織中MT2和相關炎癥因子指標的變化RT-PCR檢測肝臟組織中MT2、IL-6、TNF-α、IL-10指標變化,免疫組化檢測肝臟組織中F4/80的表達情況,Western Blot檢測P65、p-p65表達水平。5.肝臟組織中Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白的表達ELISA檢測肝臟組織中MDA、SOD指標變化,Western Blot檢測肝臟組織中Nrf2、catalase、NQO-1、HO-1的表達。結果:1.MT2對CCl_4誘導的肝纖維化保護作用(1)野生型小鼠肝臟中MT2 mRNA表達明顯高于敲基因小鼠,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。注射CCl_4后野生型小鼠體內(nèi)MT2含量顯著增加,對敲基因小鼠無明顯影響。(2)與對照組相比,注射CCl_4后兩種基因型小鼠均出現(xiàn)精神萎靡,攝食、活動減少,體重無明顯增加。(3)對照組兩種基因型小鼠血清AST、ALT、TB無明顯差異,注射CCl_4后均出現(xiàn)不同程度增高,敲基因型小鼠明顯高于野生型小鼠,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4)對照組兩種基因型小鼠肝小葉排列整齊,無明顯炎細胞浸潤,僅在匯管區(qū)有少量藍色纖維。注射CCl_4后兩組小鼠均出現(xiàn)不同程度的肝小葉結構紊亂、炎性細胞浸潤和纖維化,在敲基因組表現(xiàn)更為嚴重。(5)對照組兩種基因型小鼠肝臟組織中α-SAM表達量低,兩組無明顯差異。注射CCl_4后均出現(xiàn)不同程度增高,敲基因型小鼠明顯高于野生型小鼠,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.MT2通過調(diào)控炎癥減輕肝臟損傷(1)ELISA檢測對照組兩種基因型小鼠血清中促炎因子IL-6、TNF-α含量低,兩組無明顯差異。注射CCl_4后均出現(xiàn)不同程度增高,敲基因型小鼠明顯高于野生型小鼠,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。這與肝臟組織中RT-PCR檢測結果一致。(2)免疫組化檢測對照組兩種基因型小鼠肝臟組織中F4/80+巨噬細胞少量散在分布,注射CCl_4后均出現(xiàn)不同程度增多,并向匯管區(qū)聚集,在敲基因型小鼠更為顯著。(3)Western Blot檢測對照組兩種基因型小鼠肝臟組織中P-P65表達低,注射CCl4后出現(xiàn)不同程度增高,以敲基因型小鼠更為明顯,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.MT2通過激活Nrf2/HO-1信號通路減輕肝臟氧化應激損傷(1)對照組中,兩種基因型小鼠肝臟中MDA、SOD含量相近,注射CCl4后MDA明顯增高、SOD表達在明顯降低,在敲基因型小鼠更為顯著。(2)Western Blot檢測兩種基因型小鼠肝臟組織中Nrf2表達量無明顯差異,注射CCl4后均出現(xiàn)不同程度增高,其下游抗氧化相關蛋白catalase、NQO-1、HO-1的表達增高,在野生型小鼠更為明顯。結論:1、金屬硫蛋白2(MT2)缺失加重CCl_4誘導的肝臟組織炎癥細胞浸潤、纖維化和肝組織損傷;2、金屬硫蛋白2(MT2)對肝纖維化調(diào)控作用可能通過下調(diào)NF-κB P65信號通路抗炎和上調(diào)Nrf2/HO-1信號通路抗氧化應激來實現(xiàn)。
【圖文】：

1.1 不同基因型小鼠中MT2含量差異為確保實驗的可靠性，，本實驗首先通過鼠尾基因提取、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳確定實驗小鼠MT2是否敲除成功，結果如圖1-1A所示，僅在800bp處顯示條帶為純合子（MT-KO）（除3、12泳道外其它泳道），僅在2300bp處顯示條帶為野生型小鼠（WT）（第3泳道）。同時通過RT-PCR檢測兩種基因型小鼠肝臟組織中MT2 mRNA表達情況，結果如圖1-1B所示，對照組野生型小鼠肝臟組織中MT2 mRNA的表達量明顯高于敲基因小鼠（P＜0.05）。經(jīng)CCl4處理的野生型組小鼠肝臟組織中MT2 mRNA的表達量顯著增加，對敲基因小鼠MT2無影響（P＜0.05）。圖1-1A MT2基因擴增 B 肝臟中MT2 mRNA表達量.注：#P＜0.05 VS.野生型正常對照組.*P＜0.05 VS.野生型CCl4對照組.Fig.1-1AThe amplification of MT2 gene, B MT2 mRNA expression in liver .Note:Data were expressed as mean ± SD.#P＜0.05 VS the wide-type control group.*P＜0.05 VS thewide-type CCl4control group.1.2 一般情況對照組小鼠精神、飲食、活動正常，性情溫順，體重逐漸增加，毛發(fā)光澤。實驗組小鼠腹腔注射橄欖油稀釋四氯化碳溶液后逐漸出現(xiàn)精神萎靡，攝食、活動減少

1.3 肝功能檢測為了探討MT2是否具有改善肝功能作用，我們通過檢測小鼠血清中AST、ALT和TB水平。結果如表5及圖1-3所示：與對照組相比，CCl4組AST、ALT和TB顯著增高（P＜0.05），其中MT-K0-CCl4組AST、ALT和TB升高程度均高于WT-CCl4組，血清肝指數(shù)的變化意味著MT2具有緩解CCl4的肝毒性作用。表5 肝功能檢測組別 n AST(U/L) ALT(U/L) TB(U/L)WT 6 15.04±5.74 14.75±2.84 7.65±2.75MT-KO 6 15.76±5.94 14.42±3.92 7.79±2.83WT-CCl46 37.23±6.53*#46.01±5.63*#50.97±8.79*#MT-KO-CCl46 50.59±7.52&*58.51±10.02&*61.18±13.59*圖1-3 肝功能檢測注：#P＜0
【學位授予單位】：成都醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R575.2

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本文編號：2632944