【摘要】：目的:觀察MT2缺失在四氯化碳致小鼠肝臟功能損傷及肝纖維化中的作用,探討MT2抗肝纖維化效應(yīng)及可能機(jī)制,為臨床防治創(chuàng)傷、慢性炎癥引起的肝功能異常和肝纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.動(dòng)物模型的制備和分組取健康SPF級(18-22g)雄性C57BL野生型小鼠12只及應(yīng)用CRISPR/Cas9敲除MT2構(gòu)建MT2低表達(dá)組小鼠12只,隨機(jī)分為4組:正常對照組(WT)(6只),MT2低表達(dá)對照組(MT-KO)(6只),野生型四氯化碳組(WT-CCl_4)(6只),MT2低表達(dá)四氯化碳組(MT-K0-CCl_4)(6只)。實(shí)驗(yàn)組均通過反復(fù)腹腔注射橄欖油稀釋的四氯化碳溶液4周(四氯化碳和橄欖油以1:4體積比混勻,5ml/kg,每周兩次)誘導(dǎo)肝纖維化,建立肝纖維化模型。對照組注射等體積橄欖油。第4周末稱重后用4%水合氯醛(0.15mL/20g)腹腔注射麻醉后心臟取血收集血清和肝臟標(biāo)本,-80℃保存,備用。2.血清學(xué)指標(biāo)檢查檢測各組小鼠肝功能和相關(guān)炎癥因子血清水平:丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和總膽紅素(TB)含量,ELISA檢測血清中IL-6、TNF-α指標(biāo)變化。3.組織標(biāo)本的病理學(xué)檢查HE、Masson和天狼星紅染色觀察肝組織病理及纖維化改變,Western Blot檢測肝臟組織中α-SAM。4.肝臟組織中MT2和相關(guān)炎癥因子指標(biāo)的變化RT-PCR檢測肝臟組織中MT2、IL-6、TNF-α、IL-10指標(biāo)變化,免疫組化檢測肝臟組織中F4/80的表達(dá)情況,Western Blot檢測P65、p-p65表達(dá)水平。5.肝臟組織中Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)ELISA檢測肝臟組織中MDA、SOD指標(biāo)變化,Western Blot檢測肝臟組織中Nrf2、catalase、NQO-1、HO-1的表達(dá)。結(jié)果:1.MT2對CCl_4誘導(dǎo)的肝纖維化保護(hù)作用(1)野生型小鼠肝臟中MT2 mRNA表達(dá)明顯高于敲基因小鼠,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。注射CCl_4后野生型小鼠體內(nèi)MT2含量顯著增加,對敲基因小鼠無明顯影響。(2)與對照組相比,注射CCl_4后兩種基因型小鼠均出現(xiàn)精神萎靡,攝食、活動(dòng)減少,體重?zé)o明顯增加。(3)對照組兩種基因型小鼠血清AST、ALT、TB無明顯差異,注射CCl_4后均出現(xiàn)不同程度增高,敲基因型小鼠明顯高于野生型小鼠,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)對照組兩種基因型小鼠肝小葉排列整齊,無明顯炎細(xì)胞浸潤,僅在匯管區(qū)有少量藍(lán)色纖維。注射CCl_4后兩組小鼠均出現(xiàn)不同程度的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、炎性細(xì)胞浸潤和纖維化,在敲基因組表現(xiàn)更為嚴(yán)重。(5)對照組兩種基因型小鼠肝臟組織中α-SAM表達(dá)量低,兩組無明顯差異。注射CCl_4后均出現(xiàn)不同程度增高,敲基因型小鼠明顯高于野生型小鼠,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.MT2通過調(diào)控炎癥減輕肝臟損傷(1)ELISA檢測對照組兩種基因型小鼠血清中促炎因子IL-6、TNF-α含量低,兩組無明顯差異。注射CCl_4后均出現(xiàn)不同程度增高,敲基因型小鼠明顯高于野生型小鼠,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。這與肝臟組織中RT-PCR檢測結(jié)果一致。(2)免疫組化檢測對照組兩種基因型小鼠肝臟組織中F4/80+巨噬細(xì)胞少量散在分布,注射CCl_4后均出現(xiàn)不同程度增多,并向匯管區(qū)聚集,在敲基因型小鼠更為顯著。(3)Western Blot檢測對照組兩種基因型小鼠肝臟組織中P-P65表達(dá)低,注射CCl4后出現(xiàn)不同程度增高,以敲基因型小鼠更為明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.MT2通過激活Nrf2/HO-1信號通路減輕肝臟氧化應(yīng)激損傷(1)對照組中,兩種基因型小鼠肝臟中MDA、SOD含量相近,注射CCl4后MDA明顯增高、SOD表達(dá)在明顯降低,在敲基因型小鼠更為顯著。(2)Western Blot檢測兩種基因型小鼠肝臟組織中Nrf2表達(dá)量無明顯差異,注射CCl4后均出現(xiàn)不同程度增高,其下游抗氧化相關(guān)蛋白catalase、NQO-1、HO-1的表達(dá)增高,在野生型小鼠更為明顯。結(jié)論:1、金屬硫蛋白2(MT2)缺失加重CCl_4誘導(dǎo)的肝臟組織炎癥細(xì)胞浸潤、纖維化和肝組織損傷;2、金屬硫蛋白2(MT2)對肝纖維化調(diào)控作用可能通過下調(diào)NF-κB P65信號通路抗炎和上調(diào)Nrf2/HO-1信號通路抗氧化應(yīng)激來實(shí)現(xiàn)。
【圖文】：

1.1 不同基因型小鼠中MT2含量差異為確保實(shí)驗(yàn)的可靠性，，本實(shí)驗(yàn)首先通過鼠尾基因提取、PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳確定實(shí)驗(yàn)小鼠MT2是否敲除成功，結(jié)果如圖1-1A所示，僅在800bp處顯示條帶為純合子（MT-KO）（除3、12泳道外其它泳道），僅在2300bp處顯示條帶為野生型小鼠（WT）（第3泳道）。同時(shí)通過RT-PCR檢測兩種基因型小鼠肝臟組織中MT2 mRNA表達(dá)情況，結(jié)果如圖1-1B所示，對照組野生型小鼠肝臟組織中MT2 mRNA的表達(dá)量明顯高于敲基因小鼠（P＜0.05）。經(jīng)CCl4處理的野生型組小鼠肝臟組織中MT2 mRNA的表達(dá)量顯著增加，對敲基因小鼠MT2無影響（P＜0.05）。圖1-1A MT2基因擴(kuò)增 B 肝臟中MT2 mRNA表達(dá)量.注：#P＜0.05 VS.野生型正常對照組.*P＜0.05 VS.野生型CCl4對照組.Fig.1-1AThe amplification of MT2 gene, B MT2 mRNA expression in liver .Note:Data were expressed as mean ± SD.#P＜0.05 VS the wide-type control group.*P＜0.05 VS thewide-type CCl4control group.1.2 一般情況對照組小鼠精神、飲食、活動(dòng)正常，性情溫順，體重逐漸增加，毛發(fā)光澤。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射橄欖油稀釋四氯化碳溶液后逐漸出現(xiàn)精神萎靡，攝食、活動(dòng)減少

1.3 肝功能檢測為了探討MT2是否具有改善肝功能作用，我們通過檢測小鼠血清中AST、ALT和TB水平。結(jié)果如表5及圖1-3所示：與對照組相比，CCl4組AST、ALT和TB顯著增高（P＜0.05），其中MT-K0-CCl4組AST、ALT和TB升高程度均高于WT-CCl4組，血清肝指數(shù)的變化意味著MT2具有緩解CCl4的肝毒性作用。表5 肝功能檢測組別 n AST(U/L) ALT(U/L) TB(U/L)WT 6 15.04±5.74 14.75±2.84 7.65±2.75MT-KO 6 15.76±5.94 14.42±3.92 7.79±2.83WT-CCl46 37.23±6.53*#46.01±5.63*#50.97±8.79*#MT-KO-CCl46 50.59±7.52&*58.51±10.02&*61.18±13.59*圖1-3 肝功能檢測注：#P＜0
【學(xué)位授予單位】：成都醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575.2

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本文編號：2632944