發(fā)布時(shí)間：2020-04-18 22:01

【摘要】： 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是病毒性肝炎最常見的病原體之一。有些人初次感染HBV后不能徹底清除病毒，成為慢性HBV攜帶者甚至慢性乙型肝炎患者，從而形成肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌的高危人群。HBV持續(xù)感染與宿主的α干擾素(interferon-α，IFN-α)產(chǎn)生水平低、特異性免疫耐受、T細(xì)胞應(yīng)答不足或漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞減少及產(chǎn)生IFN-α功能受損等現(xiàn)象相關(guān)，但其確切機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。 Toll樣受體(TLRs)家族是一類病原模式識(shí)別受體(Pattern Recognition Receptors，PRRs)，介導(dǎo)識(shí)別病原體的保守分子結(jié)構(gòu)，在天然免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用。漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)為外周血中Ⅰ型干擾素生成細(xì)胞，外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)經(jīng)刺激后產(chǎn)生的IFN-α有98％以上由其產(chǎn)生。PDC主要通過TLR7和TLR9感受病毒感染并啟動(dòng)下游免疫反應(yīng)，其中TLR9識(shí)別的是細(xì)菌和病毒的DNA分子；而TLR7識(shí)別單鏈RNA等。除此之外，pDC對(duì)T細(xì)胞，B細(xì)胞，NK細(xì)胞，mDC等均有誘導(dǎo)和調(diào)控作用，是連接天然免疫和特異性免疫的橋梁。 為了探討TLR7和TLR9在慢性HBV感染病人中的作用，本研究首先分別從轉(zhuǎn)錄和蛋白水平研究了41例慢性HBV感染的不同階段病人及11例健康對(duì)照的外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR7和TLR9改變，探討TLR7和TLR9表達(dá)調(diào)控狀況與慢性HBV感染后不同階段以及原發(fā)性肝癌之間的關(guān)系。實(shí)時(shí)熒光定量PCR先證實(shí)了在患者組，HBV感染在mRNA水平抑制了TLR7和9的表達(dá)，然后免疫蛋白印跡和流式細(xì)胞檢測(cè)獲得定量，結(jié)果表明慢性HBV的感染抑制了慢性乙型肝炎及乙肝相關(guān)的原發(fā)性肝癌患者組外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR7蛋白表達(dá)。但TLR9在蛋白水平上卻隨著病程進(jìn)展及原發(fā)性肝癌的發(fā)生呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。提示TLR9表達(dá)增加可能與原發(fā)性肝癌的發(fā)生有關(guān)。我們選擇慢性乙型肝炎病人與健康對(duì)照進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎病人pDC細(xì)胞比例和數(shù)量，TLR7和TLR9的表達(dá)較正常人下降，細(xì)胞免疫組化也找到HBV表面抗原及核心抗原在慢性乙型肝炎病人pDC細(xì)胞中有表達(dá)。經(jīng)相關(guān)性分析，pDC細(xì)胞比例和數(shù)量下降，以及TLRs的表達(dá)均與血漿HBV DNA的載量相關(guān)。對(duì)TLR7和TLR9介導(dǎo)的pDC細(xì)胞制造IFN-α的功能通過ELISA方法進(jìn)行評(píng)估后發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者組的pDC喪失了經(jīng)TLRs對(duì)其相應(yīng)配體發(fā)生反應(yīng)的能力。這些結(jié)果提示我們，乙肝病毒通過某種方式抑制了免疫細(xì)胞TLR7，9的表達(dá)，因TLR7，9功能受損，，還使pDC細(xì)胞失去了對(duì)病原體發(fā)生反應(yīng)的能力，這可能是導(dǎo)致HBV持續(xù)感染，肝炎慢性化的原因。
【圖文】：

2.L慢性乙型肝炎病人PBMCs的TLR7和 TLRgmRNA表達(dá)下降用實(shí)時(shí)熒光定量PCR來定量分析TLR7和 TLRgmRNA差異表達(dá)，以p一actin為內(nèi)參，我們比較了不同HBv感染病人組與健康組的差異。如圖1所示，相對(duì)于對(duì)照組，TLR7和 TLRgmRNA表達(dá)均受到明顯抑制，分別為健康對(duì)照組的23.2或7.6倍。隨著病程進(jìn)展，TLR7抑制作用逐步減弱至與對(duì)照組無顯著性差異，從LC組到HCC組抑制倍數(shù)分別為2.8到一0.34。而TLRg雖然也有與TLR7相同的趨勢(shì)，但程度較弱，從LC組到HCC組抑制倍數(shù)分別為6和8倍。

小小BLCHCCCC圖1病人TLR7，，基因mRNA與健康對(duì)照組相比的抑制倍數(shù)注:PBMCs以T田ZOL提取RNA后，TLR7和TLRg的表達(dá)抑制率由熒光定PCR決定。相對(duì)于健康對(duì)照組，各病人組的兩種TLR受體的mRNA表達(dá)均明顯受制。數(shù)據(jù)取每個(gè)樣本三次獨(dú)立分析的平均值，以平均值士SEM表示。*顯著性差異，<0.05上圖以健康人的表達(dá)水平為基線，縱坐標(biāo)為各組病人表達(dá)水平與健康人表達(dá)平相比的抑制倍數(shù)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R512.62

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本文編號(hào)：2632583