【摘要】： 背景 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是最嚴(yán)重和最普遍的健康問(wèn)題之一,全世界約有20億人受累。盡管從1982年開(kāi)始使用HBV疫苗后,HBV感染率大為下降,全世界至今仍有超過(guò)3.5億的慢性HBV攜帶者,其中約75%分布于亞太平洋地區(qū)。隨著感染時(shí)間延長(zhǎng),HBV感染者發(fā)生肝臟功能失代償、肝硬化、肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)亦逐漸增加,全世界每年約有50-120萬(wàn)人死于HBV感染相關(guān)的終末期肝病。我國(guó)約有1.2億HBV感染者,其中2000-3000萬(wàn)為慢性活動(dòng)性肝病患者。因此,慢性HBV感染依然是一個(gè)具挑戰(zhàn)性的全球健康問(wèn)題。 HBV感染的結(jié)局與宿主的免疫狀態(tài)密切相關(guān),其中機(jī)體對(duì)HBV的免疫耐受而導(dǎo)致特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答不足是導(dǎo)致HBV感染慢性化的重要原因。慢性HBV感染的免疫學(xué)特點(diǎn)主要有:①存在不同程度的免疫耐受。HBV感染病例外周血中有大量病毒抗原,血液高濃度的病毒抗原長(zhǎng)期刺激,可能誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的Treg細(xì)胞,PD-1及CTLA-4等免疫抑制分子表達(dá)上調(diào),從而使病毒特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)低下或缺失。②抗原提呈細(xì)胞特別是樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)數(shù)量較少或功能缺陷,影響DC-T細(xì)胞間的相互作用,致使HBV抗原特異性T細(xì)胞HLA-Ⅱ表達(dá)下降,導(dǎo)致T細(xì)胞應(yīng)答減弱、增殖不足,不能激活Th細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子、或不能激活CTL的細(xì)胞毒活性;③HBV特異性TCR CDR3譜型較窄或峰形偏倚,T細(xì)胞呈單克隆性或寡克隆性增生,從而使機(jī)體對(duì)HBV抗原的識(shí)別及應(yīng)答譜較窄;④Ⅰ型及Ⅱ型輔助性T淋巴細(xì)胞(Helper T lymphocyte,Th)失平衡。在病毒復(fù)制部位T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子型可能影響感染的最后結(jié)局,特異性Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)時(shí),可促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng),有利于清除病毒;而Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)時(shí),雖然有利于產(chǎn)生針對(duì)HBV的抗體,但容易使感染慢性化。慢性HBV感染者Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2等)相對(duì)不足,而Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-10等)水平相對(duì)較高,因而維持慢性感染狀態(tài)。⑤抗病毒相關(guān)的細(xì)胞因子(TNF-α及IFN-γ等)可能存在基因突變、基因多態(tài)性或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的異常。 隨著對(duì)乙型肝炎病毒學(xué)、免疫學(xué)及慢性感染自然史認(rèn)識(shí)的提高,目前公認(rèn)HBV復(fù)制是免疫介導(dǎo)肝損傷和疾病進(jìn)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)者。自1998年以來(lái),一些有效的口服抗病毒藥物的批準(zhǔn)使用使乙型肝炎的治療發(fā)生了革命性的變化。目前批準(zhǔn)用于抗HBV治療的藥物分兩大類,注射用的干擾素(普通干擾素和長(zhǎng)效干擾素)及口服的核苷(酸)類似物(拉米夫定、阿德福韋、替比夫定和恩替卡韋等)。這些藥物可有效的抑制病毒復(fù)制和阻止疾病進(jìn)展,但卻不能完全清除病毒;核苷(酸)類似物長(zhǎng)期治療的耐藥問(wèn)題也是一個(gè)很大的缺陷。因此,我們需要尋找新的藥物或治療策略來(lái)提高慢性乙型肝炎治療的效果。 近年,醫(yī)用臭氧用于治療乙型病毒性肝炎成為一種新的探索。醫(yī)用臭氧是臭氧與醫(yī)用純氧的混合氣體,可用于治療風(fēng)濕、潰瘍性結(jié)腸炎、椎間盤(pán)突出癥等多種疾病。臭氧作用全血后產(chǎn)生活性氧(ROS,主要是H_2O_2)和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(LOPs),這兩種產(chǎn)物分別作用于血液中的各種成分(單核細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞)及內(nèi)皮細(xì)胞和其他器官,產(chǎn)生各種效應(yīng),近年來(lái)過(guò)氧化氫(H_2O_2)被認(rèn)為是動(dòng)、植物細(xì)胞中一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)信使,因此臭氧是通過(guò)其反應(yīng)產(chǎn)物間接發(fā)揮作用。中國(guó)大陸在2004年底開(kāi)始臭氧治療乙型病毒性肝炎的嘗試并且初見(jiàn)療效,醫(yī)用臭氧有望成為治療慢性乙型肝炎的一種新的策略。但其作用機(jī)制不清楚。既往研究推斷醫(yī)用臭氧具有免疫調(diào)節(jié)作用,但尚需進(jìn)一步證實(shí),因此,研究醫(yī)用臭氧的免疫作用機(jī)制具有重要的臨床意義。 目的 通過(guò)研究醫(yī)用臭氧體外對(duì)慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分泌細(xì)胞因子功能的影響, 1.探索臭氧治療CHB的細(xì)胞免疫學(xué)機(jī)理; 2.為醫(yī)用臭氧治療CHB提供基礎(chǔ)研究的證據(jù),促進(jìn)并推廣其在臨床上的應(yīng)用; 3.為CHB的治療尋找新策略,提高治療效果。 方法 1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)臭氧作用后CHB患者PBMC培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4水平:分別采集11例CHB患者和8例健康獻(xiàn)血員外周血10ml,密度梯度離心法分離PBMC,用RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸后,以不同濃度(4、10、20、40、80μg/mL)的醫(yī)用臭氧冒泡法作用后,于37℃含5%CO_2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí);設(shè)置醫(yī)用純氧(O_2,冒泡法作用)、陽(yáng)性(PHA 10μg/ml刺激)、陰性(RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基)及雙復(fù)孔自身對(duì)照組。培養(yǎng)結(jié)束后,ELISA檢測(cè)各處理組PBMC培養(yǎng)上清液中IFN-γ和IL-4的濃度,操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 2.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)臭氧作用后CHB患者CD4+和CD8+T細(xì)胞中IFN-γ和IL-4陽(yáng)性細(xì)胞的比例:分別采集8例CHB患者和6例健康獻(xiàn)血員外周血10ml,密度梯度離心法分離PBMC,用RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸后,以不同濃度(4、10、20、40、80μg/mL)的醫(yī)用臭氧冒泡法作用后,于37℃含5%CO_2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí),加入蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)阻斷劑(Brefeldin A,終濃度10μg/ml),于37℃含5%CO_2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí);設(shè)置醫(yī)用純氧(O_2,冒泡法作用)、陽(yáng)性(PHA 10μg/ml刺激)、陰性(RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基)對(duì)照組。培養(yǎng)結(jié)束后,用不同熒光染料標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞表面分子CD4及CD8進(jìn)行染色,固定破膜后用IFN-γ及IL-4熒光抗體對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子進(jìn)行染色。用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)CD4~+及CD8~+T淋巴細(xì)胞中IFN-γ及IL-4陽(yáng)性細(xì)胞的百分率,并用CellQuest軟件分析結(jié)果。 3.統(tǒng)計(jì)分析:本研究采用2×8析因設(shè)計(jì),即比較兩組人群(CHB患者和健康志愿者)分別接受8種不同處理(5個(gè)實(shí)驗(yàn)組和3個(gè)對(duì)照組)的差異。兩組人群之間及8種不同處理組之間整體差異的比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析;兩組人群內(nèi)部各處理組整體差異的比較用單因素方差分析;兩組人群之間各個(gè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);同一組人群各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn);所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果 1.兩組人群陽(yáng)性對(duì)照組IFN-γ及IL-4濃度及CD8~+和CD4~+陽(yáng)性細(xì)胞的比例均顯著高于其他處理組(P＜0.05)。 2.CHB患者PBMC經(jīng)過(guò)臭氧處理后分泌IFN-γ濃度的整體水平顯著高于健康志愿者(F=12.097,P=0.001),而IL-4的整體水平略低于健康志愿者,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.822,P=0.179)。兩人群組內(nèi)不同臭氧濃度處理IFN-γ及IL-4濃度的整體水平均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),低濃度(4μg/mL、10μg/mL)臭氧可輕微刺激IFN-γ和IL-4的分泌,而高濃度(40μg/mL、80μg/mL)臭氧則有抑制作用。 3.CHB患者CD8~+細(xì)胞中IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞的比例顯著高于健康對(duì)照組(F=5.101,P=0.026),CD4~+細(xì)胞中IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞比例均數(shù)高于健康對(duì)照組(陽(yáng)性對(duì)照組除外),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.034,P=0.845),CHB患者及健康人群組各臭氧處理組間CD8~+細(xì)胞中IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞的比例均有顯著差異(P=0.001及P=0.043),兩組人群各臭氧處理組間CD4~+細(xì)胞中IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞的比例均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。兩組人群間CD8~+及CD4~+細(xì)胞IL-4陽(yáng)性細(xì)胞比例總體水平無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),平均水平高低亦無(wú)明顯趨勢(shì)。CHB患者各臭氧處理組間CD8~+及CD4~+細(xì)胞中IL-4陽(yáng)性細(xì)胞的比例均無(wú)顯著差異(P＞0.05),健康人群組各臭氧處理組間CD8~+及CD4~+細(xì)胞中IL-4陽(yáng)性細(xì)胞的比例均有顯著差異(P=0.019及P=0.009)。隨著醫(yī)用臭氧濃度的升高IFN-γ及IL-4陽(yáng)性細(xì)胞的比例逐漸降低,可見(jiàn)低濃度醫(yī)用臭氧對(duì)PBMC有輕微刺激作用,而高濃度時(shí)則抑制PBMC分泌細(xì)胞因子。 結(jié)論 1.臭氧體外作用對(duì)CHB患者PBMC分泌細(xì)胞因子的功能有影響,可促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ)表達(dá),而對(duì)Th2型細(xì)胞因子(IL-4)的表達(dá)無(wú)顯著作用。 2.臭氧體外對(duì)CHB患者PBMC分泌細(xì)胞因子的影響與臭氧刺激濃度劑量密切相關(guān),低濃度臭氧可增強(qiáng)Th1型細(xì)胞免疫,而高濃度臭氧有抑制作用。 3.臭氧體外作用CHB患者和健康人PBMC后,對(duì)其細(xì)胞因子分泌功能的影響存在差異,對(duì)CHB患者影響較大。
【圖文】：

圖1HBv感染肝細(xì)胞和復(fù)制模式圖Fig1TherePlieationeyeleofHBV(GanemD.，，etal.2004)根據(jù)HBV全基因序列差異)8%或者S基因序列差異)4%將HBV分為8個(gè)

HBv感染肝細(xì)胞免疫模式圖
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R512.62

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本文編號(hào)：2631684