【摘要】：非編碼RNA (non-coding RNA, ncRNA)是當(dāng)前生命科學(xué)研究的前沿?zé)狳c之一,其中,microRNAs (miRNAs)是一大類新型的、細胞內(nèi)源性的單鏈非編碼小RNA,由基因組中的miRNA基因(miRNAs genes)編碼。成熟miRNAs的平均長度約22 nt,廣泛分布于各種生命體,作為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)的核心功能要素之一,主要通過與其靶mRNA (messenger RNA, mRNA)的3'-UTR區(qū)(3'-untranslated region,3'-UTR)互補結(jié)合,進而抑制mRNA的翻譯或誘導(dǎo)mRNA降解,發(fā)揮RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)效應(yīng),對細胞增殖、分化、凋亡等一系列生命現(xiàn)象發(fā)揮廣泛的生物學(xué)調(diào)控作用。 據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測,人類基因組編碼的miRNAs可能超過1000種。研究發(fā)現(xiàn),在不同的生理病理狀態(tài)下,組織、細胞的miRNAs表達譜具有獨特的時空特異性和組織特異性,miRNAs異常表達調(diào)控與腫瘤等多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。最近研究顯示,血漿或血清中的循環(huán)miRNAs (circulating miRNAs, cir-miRNAs)可能是一類具有潛在臨床應(yīng)用價值的新型生物標(biāo)志物(biomarker)。業(yè)已表明,腫瘤、心血管病等疾患個體的血漿或血清中存在如miR-92和miR-1等一些異常表達的、可能有助于疾病診斷及預(yù)后評估的循環(huán)miRNAs。 基于目前循環(huán)miRNAs的研究新進展,我們有理由推測：在正常機能狀態(tài)下,機體內(nèi)循環(huán)miRNAs的種類及其表達豐度可能處于一個相對穩(wěn)定、平衡的狀態(tài),而機體內(nèi)器官組織的功能、代謝異常或器質(zhì)性病變等因素可能會直接或間接地破壞機體內(nèi)循環(huán)miRNAs的穩(wěn)態(tài)(homeostasis),表現(xiàn)為特定生理或疾病狀態(tài)下某些循環(huán)miRNAs的表達水平的變化。 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)(簡稱慢性乙肝)、肝纖維化(liver fibrosis,LF)、肝硬化(livercirrhosis, LC)和肝細胞癌(hepatocelluler carcinoma, HCC)等肝臟疾病(簡稱肝病)依舊嚴(yán)重危害人們身體健康,進一步發(fā)展更加特異、敏感的肝臟疾病生物標(biāo)志物可以彌補ALT、AST、AFP等傳統(tǒng)血清學(xué)標(biāo)志物的不足,對于提高肝臟相關(guān)疾病的輔助診斷、評估及健康管理等具有十分重要的臨床意義。 因此,為探索循環(huán)miRNAs對于肝臟相關(guān)疾病輔助診斷的潛在意義,本論文主要進行了四個方面的工作：第一,建立利用實時定量PCR (real-time quantitative PCR, rt-qPCR)對臨床血清標(biāo)本中循環(huán)miRNAs進行定量測定的技術(shù)平臺。第二,采用基于qPCR (quantitative PCR)的TaqMan低密度陣列(TaqMan low density array, TLDA)技術(shù),對健康個體、肝細胞癌(HCC)和肝硬化(LC)患者血清參考標(biāo)本中的循環(huán)miRNAs進行了初步分析,以期篩選潛在的肝臟疾病相關(guān)的循環(huán)miRNAs。第三,通過分析篩選結(jié)果,選擇5種在HCC和LC血清中表達上調(diào)的、可能與肝臟疾病相關(guān)的miRNAs(即miR-146a,-215,-224,-573-3p和miR-885-5p)進行初步驗證。第四,基于有關(guān)文獻進行數(shù)據(jù)挖掘,分析miR-885-5p在不同人體組織中的表達及分布,進一步采用TargetScan等生物信息學(xué)軟件對miR-885-5p的潛在靶基因進行預(yù)測和分析。主要獲得以下四個方面的結(jié)果：第一,建立了循環(huán)miRNAs定量的技術(shù)路線。第二,驗證了TLDA技術(shù)用于循環(huán)miRNAs篩選的可行性。第三,發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎、肝硬化及肝細胞癌患者血清中miR-885-5p的表達豐度顯著升高。ROC (receiver operating characteristic, ROC)分析顯示,miR-885-5p用于鑒別肝臟相關(guān)疾病與健康個體時的曲線下面積(the area under curve,AUC)為0.904,特異性為79.17%,敏感性為90.53%。最后,基于文獻分析,發(fā)現(xiàn)miR-885-5p在肝臟組織中具有較高的表達水平。生物信息學(xué)分析顯示,在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(cholesterol reverse transport, CRT)及磷脂等脂類代謝中具有重要功能的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體超家族成員ABCA1 (ATP-binding cassette sub-family A member 1, ABCA1)是miR-885-5p的潛在靶基因之一。 本論文建立的技術(shù)平臺可為循環(huán)miRNAs的實時定量提供參考,發(fā)現(xiàn)并初步驗證了血清miR-885-5p可能是一種有助于肝臟疾病診斷的新型標(biāo)志物。
【圖文】：

作為預(yù)實驗，首先采集10名健康志愿者外周血并及時分離血漿，進行總RNA抽提。定量分析結(jié)果顯示，不同健康個體間血漿總RNA濃度差異很大，，其血漿總RNA濃度介于 3.sng恤L一35.4ng單L之間(圖1一l)。A

本文編號：2631637