【摘要】： 肝臟是機(jī)體最重要的代謝器官之一,而化學(xué)性肝損傷是引發(fā)多種肝臟疾病的重要始動(dòng)環(huán)節(jié)。因此,針對(duì)化學(xué)性肝損傷的發(fā)病機(jī)制以及藥物干預(yù)效應(yīng)的研究,對(duì)慢性肝病的防治具有十分重要的意義。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是研究化學(xué)誘導(dǎo)急性肝損傷發(fā)病機(jī)制的必經(jīng)之路,在研究肝臟疾病發(fā)病機(jī)制及抗肝臟疾病藥物的過程中,選擇有科學(xué)性、實(shí)用性、重現(xiàn)性的肝損傷動(dòng)物模型的意義亦十分重要。在肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究中,四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的化學(xué)性肝損傷和酒精性肝損傷模型是比較常見的兩種動(dòng)物模型。本課題將利用建立的代謝組學(xué)方法,分別對(duì)兩種肝損傷模型動(dòng)物的代謝特征開展研究,并利用代謝組學(xué)方法對(duì)藥物干預(yù)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。同時(shí),在動(dòng)物模型研究的基礎(chǔ)上,本課題進(jìn)一步嘗試?yán)么x組學(xué)方法,對(duì)臨床原發(fā)性肝癌(PLC)患者的代謝特征進(jìn)行分析,探索將代謝組學(xué)方法應(yīng)用于臨床疾病機(jī)制研究的新思路。 本課題首先建立了基于色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的肝組織的代謝組學(xué)研究方法。在此基礎(chǔ)上,重點(diǎn)考察了CCl4及酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠尿液及肝組織的代謝譜變化,并從代謝水平觀察甘利欣對(duì)CCl4誘導(dǎo)化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。同時(shí),在整體代謝水平上分析了臨床肝癌病人與正常對(duì)照人群的代謝譜差異。本課題的主要內(nèi)容和結(jié)果如下: 1.建立了基于氯甲酸乙酯衍生化(ECF)的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)分析以及基于三甲基硅烷(TMS)衍生的氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC/TOFMS)分析的肝組織代謝組學(xué)研究方法。針對(duì)前者的分析特點(diǎn),采用高氯酸乙醇兩步提取法提取肝組織中的小分子內(nèi)源性代謝物,后者采用氯仿/甲醇/水的混合溶劑進(jìn)行兩步提取。兩種分析方法均經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證表明重復(fù)性好、靈敏度高、精密度高,適用于肝組織的快速、高通量檢測(cè)。 2.采用ECF衍生、GC/MS分析的代謝組學(xué)研究方法,嘗試著從整體代謝水平上考察大鼠在CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷過程中尿液及肝組織中內(nèi)源性小分子代謝物譜的變化,并觀察甘利欣預(yù)防性給藥對(duì)CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷的保護(hù)作用。結(jié)合多維統(tǒng)計(jì)方法,發(fā)現(xiàn)肝損傷大鼠尿液和肝組織樣本中小分子內(nèi)源性代謝物發(fā)生了明顯變化,并找到使得正常組和模型組區(qū)分開的相關(guān)差異性代謝物,且尿液和肝組織樣本代謝譜所提供的信息相互補(bǔ)充,經(jīng)初步分析CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷與三羧酸循環(huán)、部分氨基酸代謝等高度相關(guān)。 3.以酒精誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型為研究對(duì)象,采用ECF衍生、GC/MS分析的代謝組學(xué)研究方法檢測(cè)了大鼠尿液及肝組織中內(nèi)源性小分子代謝物譜的模式變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋氨酸代謝、三羧酸循環(huán)及脂肪酸代謝等代謝通路變化與酒精誘導(dǎo)的急性肝損傷密切相關(guān)。且模型組大鼠尿液及肝組織中部分代謝物的變化趨勢(shì)與CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠的相類似。 4.分別采用ECF衍生尿液的GC/MS及TMS衍生血清的GC/TOFMS方法,對(duì)肝癌患者和正常對(duì)照人群的尿液及血液進(jìn)行代謝組學(xué)研究,嘗試為肝癌診斷以及肝癌的病理機(jī)制理解尋找新的切入點(diǎn)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),正常人與肝癌患者尿液和血液的代謝譜均有分離趨勢(shì),進(jìn)一步利用監(jiān)督的正交偏最小方差判別分析(OPLS-DA)方法能 清晰地觀察到肝癌患者與正常對(duì)照之間尿液和血液代謝輪廓的差異,通過對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)變化的分析發(fā)現(xiàn)了與肝癌臨床病理相關(guān)的代謝通路  能量代謝、苯丙氨酸、色氨酸、糖代謝以及一些其它的氨基酸代謝的變化。 本課題在建立肝組織代謝組學(xué)方法的基礎(chǔ)上,應(yīng)用傳統(tǒng)藥理學(xué)指標(biāo)與代謝組學(xué)研究所揭示的生物化學(xué)變化相結(jié)合的方法,為CCl4及酒精誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷的機(jī)制研究及藥物藥效作用的整體評(píng)價(jià)提供新的思路和視野;并且發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)技術(shù)在肝癌的早期診斷甚至分期上有很大的潛力,可以為臨床診斷提供科學(xué)依據(jù),非常值得進(jìn)行深入一步的研究。
【圖文】：

32圖 2-1 不同提取方案對(duì)肝組織提取的總離子流色譜圖Fig. 2-1 Typical GC/MS total ion current (TIC) chromatograms of liver tissue samples extractedby different solvents.2.4.2 氯仿/甲醇/水提取效果采用氯甲酸乙酯衍生方法分析肝組織，得到的代謝物大部分是氨基酸、游離脂肪酸和一些小分子有機(jī)酸類，為了檢測(cè)到更多的物質(zhì)如糖類、嘧啶及腺苷等，

綜合分析前面所考察的氯仿/甲醇/水提取方法，主要以水和有機(jī)相、以及有機(jī)相中氯仿和甲醇的配比為考察對(duì)象。將經(jīng)過不同提取條件所得的代謝物經(jīng)衍生化后分析比較發(fā)現(xiàn)，其中 3，11，12，14，15，17 號(hào)進(jìn)樣瓶中有大量沉淀，導(dǎo)致無法進(jìn)樣，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)這 6 個(gè)試驗(yàn)條件中提取溶劑均為水：有機(jī)相>2：3（有機(jī)相體積為氯仿和甲醇的體積和），猜測(cè)可能的原因是提取溶劑中水含量太多，以致蛋白質(zhì)沉淀不完全。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)：當(dāng)提取溶劑中氯仿過多時(shí)（氯仿：甲醇>2：3），，提取溶劑發(fā)生分層，且組織沉淀物聚集在中間層，不利于操作（取下層液體），本試驗(yàn)中不考慮這種方法。接下來比較表 2-4 中實(shí)驗(yàn)編號(hào)分別為 1，9，4，2，13 試驗(yàn)條件所得的總離子流色譜圖（圖 2-2）。從圖 2-2 中觀察到，當(dāng)水在混合溶劑中所占的比例過大時(shí)（如 1 和 9 中），則發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間為 17min 和 27.5min 左右的糖峰過大，掩蓋了許多較小的峰。因此，為了避免糖峰的干擾，將水和有機(jī)相之間的比例縮小到0～1：3。1
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R575;R735.7

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李常曉;張榮;王朝霞;;應(yīng)用代謝組學(xué)方法探討肝損傷患兒的生物標(biāo)志物[J];臨床兒科雜志;2012年06期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 高翠紅;肝細(xì)胞肝癌患者尿液的代謝組學(xué)研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

2 高潔;肝細(xì)胞肝癌患者腹水潛在代謝標(biāo)志物的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

3 李常曉;兒童感染性肝損傷的血清代謝組學(xué)初步研究[D];吉林大學(xué);2012年

4 牟紅元;基于質(zhì)譜信號(hào)的正交投影方法及其在中藥代謝組學(xué)研究中的應(yīng)用[D];蘇州大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2631510