【摘要】： 內(nèi)毒素(endotoxin, ET)主要的毒性成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),是革蘭氏陰性(Gˉ)細(xì)菌細(xì)胞壁上的主要成份,也是Gˉ細(xì)菌最為重要的致病物質(zhì),可激活單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(mononuclear phagocytic system, MPS)引起腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白三烯(leukotriene)等細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)大量釋放,導(dǎo)致肝損傷甚至是肝功能衰竭的發(fā)生,而機(jī)體或細(xì)胞經(jīng)小劑量LPS處理后所誘導(dǎo)的內(nèi)毒素耐受(endotoxin tolerance,ETT)則對LPS的再次刺激呈低反應(yīng)性。目前認(rèn)為,內(nèi)毒素耐受是生物在長期進(jìn)化過程中形成的一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,是一種適應(yīng)性應(yīng)答,能避免機(jī)體對LPS刺激的持續(xù)過度反應(yīng),是機(jī)體防御機(jī)制的重要組成部分。這就提示如能調(diào)動機(jī)體的內(nèi)源性抗損傷機(jī)制,使其在隨后受到細(xì)菌或毒素感染時,即能發(fā)揮抗感染的有益作用,又不致于引發(fā)過度炎癥反應(yīng),無疑對肝損傷的防治具有重要作用。我所諸多動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn),各種慢性肝炎、肝硬化動物和患者均伴有腸源性內(nèi)毒素血癥(IETM),有報道認(rèn)為,小劑量LPS處理可以減輕急性肝損傷,而多次小劑量LPS處理與慢性肝損傷的關(guān)系及機(jī)制國內(nèi)外報道尚屬罕見,值得進(jìn)一步研究。 本論文共分兩部分。第一部分：多次小劑量LPS處理對CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷的影響及其相關(guān)信號分子的變化；第二部分：多次小劑量LPS處理對非酒精性脂肪性肝炎發(fā)生發(fā)展的影響及其機(jī)制研究。 第一部分探討多次小劑量LPS處理對CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷的影響及其相關(guān)信號分子的變化 實(shí)驗(yàn)一多次小劑量LPS處理對CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷的影響 選取雄性Wistar大鼠34只,隨機(jī)分為正常對照組、肝損傷組和LPS處理組。肝損傷組經(jīng)皮下注射CCl4并同時飼以高脂飲食誘導(dǎo)慢性肝損傷,LPS處理組經(jīng)腹腔注射小劑量LPS,余同肝損傷組。實(shí)驗(yàn)第4周末大鼠在1%戊巴比妥鈉麻醉下,無菌無熱原條件下取腹主動脈血,用于測定內(nèi)毒素水平和ALT活性；取肝組織測定TNF-α水平；制備肝臟切片,觀察肝臟病理改變。結(jié)果：肝損傷組血漿內(nèi)毒素水平、ALT活性、肝勻漿TNF-α水平均明顯高于正常對照組；而經(jīng)小劑量LPS處理后血漿ALT活性、肝勻漿TNF-α水平顯著低于肝損傷組；肝組織切片HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),肝損傷組肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變性,可見細(xì)胞核被擠壓在細(xì)胞邊緣；肝組織內(nèi)可見肝細(xì)胞點(diǎn)狀及灶狀壞死,壞死區(qū)有以淋巴細(xì)胞為主的慢性炎細(xì)胞浸潤；而LPS處理組肝細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡以小空泡為主、數(shù)量少,肝脂肪變性明顯減輕,同時肝組織淋巴細(xì)胞浸潤少。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后提示CCl4所致肝損傷伴有腸源性內(nèi)毒素血癥；經(jīng)多次小劑量LPS處理可以減輕肝損傷。 實(shí)驗(yàn)二TLR4在多次小劑量LPS處理減輕CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷中的作用 本部分實(shí)驗(yàn)采用Western blotting測定各組肝組織中TLR4表達(dá)。實(shí)驗(yàn)動物同實(shí)驗(yàn)一。結(jié)果表明,肝損傷組TLR4表達(dá)與正常對照相比,明顯增強(qiáng)；經(jīng)多次小劑量LPS處理后肝組織中TLR4表達(dá)明顯下調(diào),與肝損傷組相比差異有顯著性。 實(shí)驗(yàn)三在多次小劑量LPS處理減輕CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷中p38MAPK的表達(dá) 該實(shí)驗(yàn)采用Western blotting觀察各組肝組織中p38MAPK表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)動物同實(shí)驗(yàn)一。結(jié)果顯示,各組總p38MAPK表達(dá)一致,而pp38MAPK在肝損傷組的表達(dá)明顯增強(qiáng),經(jīng)多次小劑量LPS處理后,顯著減弱。 實(shí)驗(yàn)四在多次小劑量LPS處理減輕CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷中NF-κB與IκB的表達(dá) 該實(shí)驗(yàn)主要采用Western blotting觀察各組肝組織中NF-κB與IκB表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)動物同實(shí)驗(yàn)一。結(jié)果：肝損傷組與正常對照組相比,NF-κB表達(dá)明顯增強(qiáng),IκB表達(dá)明顯減弱；而LPS處理組NF-κB表達(dá)明顯減弱,IκB表達(dá)明顯增強(qiáng)。 實(shí)驗(yàn)五在多次小劑量LPS處理減輕CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷中IRAK-M的表達(dá) 該實(shí)驗(yàn)主要采用Western blotting觀察各組肝組織中IRAK-M表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)動物同實(shí)驗(yàn)一。結(jié)果：小劑量LPS處理可明顯增強(qiáng)肝組織IRAK-M表達(dá)水平,與肝損傷組相比差異有顯著性。 綜合第一部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,歸納如下：①CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷大鼠模型體內(nèi)存在腸源性內(nèi)毒素血癥,腸源性內(nèi)毒素也是造成慢性肝損傷的重要原因。②經(jīng)多次小劑量LPS處理可以減輕CCl4誘導(dǎo)的慢性肝損傷；③TLR4表達(dá)下調(diào)是LPS處理減輕慢性肝損傷的機(jī)制之一。④LPS處理可能通過上調(diào)IRAK-M水平,阻礙了MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而使致炎因子,尤其是TNF-α產(chǎn)生減少,從而減輕了CCL4誘導(dǎo)的慢性肝損傷。 第二部分多次小劑量LPS處理對非酒精性脂肪性肝炎的影響及其機(jī)制研究 實(shí)驗(yàn)六多次小劑量LPS處理對高糖高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎的影響 隨機(jī)將雄性Wistar大鼠分為正常對照組、肝損傷組和LPS處理組。肝損傷組飼以高糖高脂飲食,LPS處理組隔日經(jīng)皮下注射小劑量LPS,余同肝損傷組。分別在實(shí)驗(yàn)第4周末、第9周末,1%戊巴比妥鈉麻醉下,無菌無熱原條件下取腹主動脈血,離心后檢測血漿ET、ALT、TNF-α、IL-10、APN、FPG, FINS水平。取肝左葉10%福爾馬林固定,石蠟包埋,5μm切片,做HE染色光鏡觀察肝組織病理變化,作TUNEL染色觀察各組肝細(xì)胞凋亡變化。結(jié)果：4周肝損傷組內(nèi)毒素、ALT水平均略高于正常組,差異沒有顯著性；9周肝損傷組血漿內(nèi)毒素水平、ALT水平均明顯高于正常對照組,提示肝損傷組大鼠體內(nèi)形成了腸源性內(nèi)毒素血癥,肝組織損傷明顯,肝組織切片HE染色也顯示,9周肝損傷組肝臟出現(xiàn)以大泡性脂滴為主的脂肪變性,肝小葉和匯管區(qū)有大量炎細(xì)胞浸潤,可見點(diǎn)狀和灶狀壞死,而9周LPS處理組血漿ALT水平明顯降低,脂肪數(shù)量少、空泡小,脂肪變性明顯減輕；LPS處理組促炎因子TNF-α水平降低,抗炎因子IL-10水平升高,Th1/Th2降低。肝細(xì)胞作為LPS的靶細(xì)胞,經(jīng)小劑量LPS處理,凋亡率低于肝損傷組,差異有顯著性。 試驗(yàn)七多次小劑量LPS處理對胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞凋亡的影響 該實(shí)驗(yàn)通過采用TUNEL法觀察胰島β細(xì)胞凋亡的改變。結(jié)果,經(jīng)小劑量LPS處理后,β細(xì)胞凋亡明顯減少；胰島素抵抗指數(shù)比肝損傷組有所降低,但差異沒有顯著性,可能與試驗(yàn)時間短有關(guān)。 綜合第二部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,歸納如下：①高糖高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎存在腸源性內(nèi)毒素血癥,腸源性內(nèi)毒素可能是非酒精性脂肪性肝炎發(fā)生發(fā)展的重要原因；②多次小劑量LPS處理可以減輕非酒精性脂肪性肝炎；③TH1/TH2下降可能是多次小劑量LPS處理減輕肝損傷的機(jī)制之一；④肝細(xì)胞凋亡下降與肝損傷減輕相關(guān)；⑤多次小劑量LPS處理可使胰島β細(xì)胞凋亡減少、胰島素抵抗指數(shù)下降。 綜上所述,得出以下結(jié)論： 1、經(jīng)多次小劑量LPS處理均可減輕CCl4及高糖高脂對大鼠所致的慢性肝損傷。 2、多次小劑量LPS處理減輕CCl4所致的慢性肝損傷與受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受阻致使致炎因子,主要是TNF-α的減少有關(guān)。 3、多次小劑量LPS處理減輕高糖高脂所致的非酒精性脂肪肝炎及其相關(guān)的胰島素抵抗和p細(xì)胞凋亡下降與M1/M2(與TH1/TH2相對應(yīng))比值下降有關(guān)。 4、無論CCl4還是高糖高脂所致的肝損傷均與激活巨噬細(xì)胞相關(guān),而多次小劑量LPS處理減輕肝損傷可能都是通過抑制巨噬細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

肝損傷組血漿內(nèi)毒素水平明顯高于正常對照組(尸<肝損傷模型大鼠在第4周時在體內(nèi)形成了腸源性內(nèi)毒素血癥;而低于肝損傷組，，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異沒有顯著性。這個結(jié)果表明，導(dǎo)致，腸源性內(nèi)毒素也發(fā)揮了重要作用。性變化2.結(jié)果顯示，肝損傷組血漿Al丁r活性明顯高于正常對照組，統(tǒng)計(jì))，提示經(jīng)CCh誘導(dǎo)的大鼠模型有慢性肝損傷形成。經(jīng)小劑量顯低于肝損傷組，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性(P<0.01)，提示，該

theliverofratstreatedwithCC14.又士s，n=8 (*P<0.05vsETT)圖1一3小劑量LPS處理對CC14誘導(dǎo)大鼠肝組織勻漿TNF一含量的影響TNF一a是引起肝損傷的重要促炎細(xì)胞因子，可由LPs誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)檢測了經(jīng)皮下注射40%cch油溶液4周后肝臟TNF一a含量變化。Fig.1一3.結(jié)果表明，CCh所致肝損傷組，肝勻漿詡F一a水平明顯高于正常對照組(p<0.01)，雖LPS處理組肝勻漿TNF一a水平仍高于對照組，但卻明顯低于肝損傷組(p<0.05)，提示，I’NF一a分泌減少，是多次小劑量LPS處理抑制CCL4慢性肝損傷主要機(jī)制之一。總之
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R575

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本文編號：2631416