【摘要】： 肝纖維化是肝臟對慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng),是一種漸進的病理過程,以細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)增生為特征。近年來的研究表明,相對進展期的肝纖維化在去除了損傷因素后是可逆的,而在肝纖維化逆轉(zhuǎn)這一過程中起關(guān)鍵作用的是肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)的凋亡,因此,誘導(dǎo)肝星狀細胞凋亡成為阻止肝纖維化進程的途徑之一。研究顯示在肝纖維化形成及恢復(fù)階段,枯否細胞(kupffer cell,KC)發(fā)揮了雙刃劍的作用。在肝纖維化進展期可促進HSC的激活,促進肝纖維化的形成;在肝纖維化恢復(fù)期,KC及活化的HSC可通過表達腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducingligand,TRAIL)及其他凋亡刺激因子從而促進HSC的凋亡,促進ECM的降解,從而抑制肝纖維化的形成。 鑒于HSC在肝纖維化發(fā)病中的重要作用及KC對HSC可能具有的雙向調(diào)節(jié)作用,本研究擬選用CCl_4誘導(dǎo)的自愈性肝纖維化模型,研究KC在肝纖維化恢復(fù)期的促HSC凋亡作用,探討其主要發(fā)揮作用的細胞因子TRAIL可能的HSC內(nèi)信號傳導(dǎo)通路以及來氟米特(leflunomide,Lef)對該通路的影響。研究內(nèi)容主要包括以下三個部分: 1.確定肝纖維化病程的進展期和恢復(fù)期分期 在分別建立的8w、12w和16w由CCl_4誘導(dǎo)的自愈性肝纖維化模型上,經(jīng)動態(tài)觀察肝臟的病理組織學(xué)改變,結(jié)合能夠敏感反應(yīng)肝纖維化程度的血清學(xué)指標(HA,HA,LN,PCⅢ,CⅣ)和組織學(xué)指標—組織羥脯氨酸含量(Hydroxyproline,Hyp)的變化,初步確定CCl_4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型的進展期和恢復(fù)期:進展期為模型12w,恢復(fù)期為12w模型恢復(fù)4w。 TUNEL和α-SMA雙重染色顯示,隨著HSC的活化,HSC出現(xiàn)自發(fā)性凋亡,且凋亡的發(fā)生隨激活進程而逐漸增加;而在肝纖維化恢復(fù)時期,隨著恢復(fù)時間的延長,HSC的凋亡逐漸減少。提示由于HSC總數(shù)減少,HSC凋亡比例亦隨之減少,表明活化HSC主要通過凋亡來終結(jié)其活化。RT-PCR結(jié)果表明,伴隨活化HSC的凋亡,TIMP-1的mRNA的表達減少,而MMP_(13)的mRNA的表達隨恢復(fù)時間的延長沒有明顯改變,始終維持在一個較高的水平。提示TIMPs表達水平的下降,解除了其對MMPs的抑制作用,使MMPs的活性增加,膠原分解增加,促使已形成的ECM降解,從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化。 2.探討肝纖維化恢復(fù)期TRAIL的HSC內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 TRAIL是腫瘤壞死因子家族成員中繼腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、FasL之后發(fā)現(xiàn)的第三個凋亡分子,其與細胞膜TRAIL受體結(jié)合從而發(fā)揮生物學(xué)作用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)5種TRAIL受體,其中TRAIL-R1/DR4與TRAIL-R2/DR5含有死亡域,與TRAIL結(jié)合可誘導(dǎo)細胞凋亡。TRAIL-R3/DcR1、TRAIL-R3/DcR2及OGP不含死亡域,與TRAIL結(jié)合不能誘導(dǎo)細胞凋亡。同時人肝細胞表面幾乎不表達TRAIL-R2/DR5受體,因此,TRAIL選擇性誘導(dǎo)HSC凋亡的作用使其在肝纖維化的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。 本研究采用Western-blot檢測肝纖維化不同時期KC中TRAIL及HSC中TRAIL-R的表達及α-SMA和TRAIL-R2免疫熒光雙染結(jié)果發(fā)現(xiàn),活化的HSC表達DR4和DR5,靜止的HSC表達DcR1和DcR2。將不同時期HSC和KC共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),KC通過TRAIL經(jīng)DR5誘導(dǎo)共培養(yǎng)體系中HSC的凋亡,且活化的HSC對TRAIL介導(dǎo)的凋亡更加敏感。將外源性寡聚化的FLAG-TRAIL預(yù)處理恢復(fù)期的HSC發(fā)現(xiàn),在肝纖維化恢復(fù)期TRAIL經(jīng)線粒體通路誘導(dǎo)HSC凋亡。上述結(jié)果提示,在肝纖維化恢復(fù)期,KC可通過TRAIL經(jīng)DR5死亡受體通過線粒體途徑介導(dǎo)HSC的凋亡。 3.探討肝纖維化恢復(fù)期Lef對HSC內(nèi)TRAIL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響 HSC的激活、增殖是肝纖維化發(fā)生的一個中心環(huán)節(jié),然而誘導(dǎo)或促進激活的HSC凋亡可避免或減少HSC聚積,這也可能成為抗肝纖維化治療的重要對策之一。本研究顯示,Lef活性代謝物,A771726(0.01,0.1和1μmol/L)預(yù)處理可明顯促進肝纖維化恢復(fù)期HSC的凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)A771726通過下調(diào)c-FLIP及RIP的表達,活化凋亡發(fā)生的死亡受體通路及上調(diào)Bid的表達,激活線粒體通路來誘導(dǎo)活化的HSC凋亡。以上實驗結(jié)果綜合說明了誘導(dǎo)HSC凋亡是來氟米特在肝纖維化治療中的又一個作用機制。
【圖文】：

圖.2.肝組織切片Masson染色(Massonxloo)Fig.2.ofliversectionsstainedwithMasson，5triehrome(originmagnlfieationx100).A:Control;B:Medel(sw);C:Medel(12w):D:Model(16w);E:4wspon加LneousreeoveryafterinjectingCCI;12w;F:swsPontaneousreeoveryafterinjectingCCI;12w47

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文4.1.5肝纖維化不同時期價SMA陽性HSC細胞的變化a一sMA陽性是Hsc活化的標志[361，正常大鼠肝竇內(nèi)無a一sMA陽性表達細胞CC玩攻擊sw的大鼠肝竇內(nèi)a一SMA陽性表達細胞明顯增多(尸<0.01)，主要分于纖維間隔內(nèi);12w大鼠肝組織中a一SMA呈強陽性表達，陽性細胞密布于匯管纖維間隔和炎性細胞浸潤區(qū)。12w的模型大鼠停止注射CCh恢復(fù)4w和sw后a一SMA陽性細胞明顯減少(尸<0.01)，在匯管區(qū)的動、靜脈壁，，肝竇處散在表。SMA陽性細胞記數(shù)方法:每張切片選取30個高倍視野(‘40)，記數(shù)a一sMA陽細胞總數(shù)。見圖3，4o
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R575.2

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本文編號：2631432