【摘要】：研究背景和目的:肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)是在慢性肝病和/或門脈高壓的基礎(chǔ)上出現(xiàn)肺內(nèi)微血管異常擴張(intrapulmonary micro-vessel dilation,IPVD)、氣體交換障礙、動脈血氧合作用異常而導(dǎo)致的一種嚴重肺部并發(fā)癥。其發(fā)生明顯增加了肝病患者圍術(shù)期死亡率,也是引起術(shù)后移植肝無功能及肺部感染的主要原因,已經(jīng)引起了國內(nèi)外肝病學和危重病學專家的極大關(guān)注。研究報道肝移植術(shù)后普通肝硬化患者存活時間中位數(shù)為87個月,5年生存率為63%,而肝肺綜合征患者僅24個月,5年生存率僅23%。中國是肝病大國,肝肺綜合征的發(fā)生會顯著增加患者、醫(yī)院和社會的醫(yī)療負擔。血管新生是一個由眾多細胞和信號通路參與的過程,在癌癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。新生血管與一般血管相似,其作用是通過血液將氧氣與養(yǎng)分輸送到細胞,但是,除外某些特定的生理情況,如懷孕、創(chuàng)口修復(fù)等,當出現(xiàn)過度的、病理性血管新生時,往往引發(fā)疾病。既往文獻報道和我們前期研究中發(fā)現(xiàn)HPS重癥化更為重要的病理特征是肺部病理性微血管新生的形成,亟待針對其機制進行深入研究。此外,新近研究發(fā)現(xiàn)外泌體廣泛參與多種疾病的病理生理過程,并發(fā)揮了重要的作用。但外泌體在肝肺綜合征發(fā)生和發(fā)展中的作用,目前尚不清楚。因此,本文以CBDL大鼠結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠肝肺綜合征模型為研究對象,研究外周血液中外泌體在肝肺綜合征病理性血管新生過程中的作用及具體分子機制,研究結(jié)果對深入理解肝肺綜合征的發(fā)生機制具有重要意義,為HPS的治療提供理論依據(jù)。此外,群體細胞遷移在血管生成過程中有重要作用。為了更好的理解細胞群體遷移的調(diào)控機制,我們決定選擇果蠅卵室發(fā)育過程中發(fā)生群體細胞遷移的邊界細胞團作為研究對象,開展相關(guān)研究,以期發(fā)現(xiàn)其中的一些共性,更好的闡明肝肺綜合征血管新生過程的具體機制。研究方法:1.構(gòu)建HPS大鼠模型,提取并鑒定血清外泌體,觀察PMVECs對其的吸收情況構(gòu)建運用膽總管結(jié)扎術(shù)(CBDL)誘導(dǎo)的HPS大鼠模型,5周后進行血氣、肝功、血流動力學測定以及肝肺組織病理切片分析,取假手術(shù)組和HPS組大鼠外周動脈血血清運用差速離心法提取外泌體,運用Western blot、TEM和NTA法鑒定外泌體,再用BCA測定外泌體濃度變化。最后,運用PKH67標記外泌體,與PMVECs共培養(yǎng),觀察對外泌體的吸收情況。2.觀察血清外泌體對PMVECs增殖、遷移及成管的影響將血清外泌體與PMVECs共培養(yǎng),通過流式細胞術(shù)分析細胞周期及增殖情況;運用Transwell小室實驗和劃痕試驗觀察PMVECs的遷移情況;采用Matrial膠體外管腔形成法觀察成管能力的變化。3.利用miRNA生物芯片篩查外泌體miRNA差異表達譜,并進行qRT-PCR驗證對大鼠外周血血清外泌體進行miRNA生物芯片篩查,得到差異表達的miRNA,運用qRT-PCR進行驗證。4.觀察miR-194對PMVECs增殖、遷移及成管的影響將miR-194激動劑和抑制劑轉(zhuǎn)染PMVECs,通過流式細胞術(shù)分析細胞周期及增殖情況;運用Transwell小室實驗和劃痕試驗觀察PMVECs的遷移情況;采用Matrial膠體外管腔形成法觀察成管能力的變化。5.生物信息學分析并驗證潛在的miR-194靶基因運用Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-194的靶基因,運用Amigo數(shù)據(jù)庫搜集負調(diào)控血管生成的基因,取兩組數(shù)據(jù)的交集,得到miR-194潛在的調(diào)控血管生成的靶基因,運用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)進行驗證。6.分析HPS時血清中增加的外泌體的分泌細胞對可能導(dǎo)致血清外泌體和外泌體內(nèi)miR-194增加的細胞進行篩查,并模擬體內(nèi)條件運用膽汁酸刺激篩查出的細胞,觀察其分泌外泌體和miR-194的變化7.在體和離體水平驗證肝細胞內(nèi)P53通路介導(dǎo)的外泌體分泌在HPS血管生成中作用運用P53抑制劑pifithrin-μ、P53 RNAi探討P53對膽汁酸處理后肝細胞中TASP6表達、培養(yǎng)基里外泌體濃度以及外泌體miR-194含量的影響。CBDL模型大鼠靜脈注射pifithrin-μ、GW4869或anta-miR-194,觀察其對肺血管生成及存活率的影響。進一步分析了HPS患者和大鼠血清胞外泌體miR-194水平和P(A-a)O_2的相關(guān)性。8.在果蠅卵室內(nèi)利用活體成像和光遺傳學技術(shù),觀察Myo-II流動在群體細胞遷移中的具體作用結(jié)果:1.成功構(gòu)建運用膽總管結(jié)扎術(shù)(CBDL)誘導(dǎo)的HPS大鼠模型,并從外周血清中提取出外泌體,發(fā)現(xiàn)肝肺綜合征大鼠血清外泌體濃度存在顯著改變,PKH-67標記的血清外泌體可以被PMVECs吸收。2.來源于肝肺綜合征大鼠血清的外泌體可以顯著促進PMVECs的增殖、遷移及成管效應(yīng)。3.miRNA生物芯片及qRT-PCR驗證結(jié)果提示miR-194在肝肺綜合征大鼠血清的外泌體內(nèi)表達顯著升高。4.miR-194可以顯著促進PMVECs的增殖、遷移及成管效應(yīng)。5.miR-194發(fā)揮的促血管生成效應(yīng)可能是由其靶基因THBS1,STAT1和LIF介導(dǎo)的。6.膽汁酸刺激下,肝細胞分泌的外泌體和外泌體miR-194增加。7.膽汁酸刺激下,P53核轉(zhuǎn)位增加。pifithrin-μ和P53 RNAi均顯著抑制TASP6表達、下調(diào)培養(yǎng)基中外泌體濃度和外泌體miR-194水平。在體情況下,CBDL模型大鼠靜脈注射pifithrin-μ、GW4869或anta-miR-194治療后,血清外泌體濃度降低,外泌體源性miR-194水平也降低,肺血管生成減少,存活率提高。8.研究發(fā)現(xiàn)群體細胞遷移過程中存在兩種不同的Myo-II流,它們與E-鈣黏素偶聯(lián),控制著邊界細胞在護理細胞之間移動時前端突起的生長和后端細胞膜間的分離。前導(dǎo)細胞中Myo-II和E-鈣黏素的雙向流動與突起的生長和肌動蛋白逆向流動相關(guān),它們反過來控制突起的生長和肌動蛋白的極化。相反,在跟隨細胞中,單向脈沖式Myo-II和E-鈣黏素流促進了其與護理細胞間的動態(tài)分離。結(jié)論:1.我們證明了肝肺綜合征大鼠血清外泌體miR-194介導(dǎo)肝細胞與PMVEC之間的串話,并有助于PMVEC增殖,遷移和管形形成。外泌體/miR-194軸在肺血管新生中起關(guān)鍵的病理作用。這些發(fā)現(xiàn)表明,外泌體可能是肝肺綜合征治療的一個潛在的靶點。2.果蠅卵室邊界細胞群體遷移過程中獨特的Myo-II流動作為一個關(guān)鍵的生物力學機制,控制多細胞環(huán)境里群體細胞遷移過程中前導(dǎo)細胞突起的生長和跟隨細胞膜的分離。
【學位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R575;R563

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