【摘要】：研究背景和目的:肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)是在慢性肝病和/或門(mén)脈高壓的基礎(chǔ)上出現(xiàn)肺內(nèi)微血管異常擴(kuò)張(intrapulmonary micro-vessel dilation,IPVD)、氣體交換障礙、動(dòng)脈血氧合作用異常而導(dǎo)致的一種嚴(yán)重肺部并發(fā)癥。其發(fā)生明顯增加了肝病患者圍術(shù)期死亡率,也是引起術(shù)后移植肝無(wú)功能及肺部感染的主要原因,已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外肝病學(xué)和危重病學(xué)專(zhuān)家的極大關(guān)注。研究報(bào)道肝移植術(shù)后普通肝硬化患者存活時(shí)間中位數(shù)為87個(gè)月,5年生存率為63%,而肝肺綜合征患者僅24個(gè)月,5年生存率僅23%。中國(guó)是肝病大國(guó),肝肺綜合征的發(fā)生會(huì)顯著增加患者、醫(yī)院和社會(huì)的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。血管新生是一個(gè)由眾多細(xì)胞和信號(hào)通路參與的過(guò)程,在癌癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。新生血管與一般血管相似,其作用是通過(guò)血液將氧氣與養(yǎng)分輸送到細(xì)胞,但是,除外某些特定的生理情況,如懷孕、創(chuàng)口修復(fù)等,當(dāng)出現(xiàn)過(guò)度的、病理性血管新生時(shí),往往引發(fā)疾病。既往文獻(xiàn)報(bào)道和我們前期研究中發(fā)現(xiàn)HPS重癥化更為重要的病理特征是肺部病理性微血管新生的形成,亟待針對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入研究。此外,新近研究發(fā)現(xiàn)外泌體廣泛參與多種疾病的病理生理過(guò)程,并發(fā)揮了重要的作用。但外泌體在肝肺綜合征發(fā)生和發(fā)展中的作用,目前尚不清楚。因此,本文以CBDL大鼠結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠肝肺綜合征模型為研究對(duì)象,研究外周血液中外泌體在肝肺綜合征病理性血管新生過(guò)程中的作用及具體分子機(jī)制,研究結(jié)果對(duì)深入理解肝肺綜合征的發(fā)生機(jī)制具有重要意義,為HPS的治療提供理論依據(jù)。此外,群體細(xì)胞遷移在血管生成過(guò)程中有重要作用。為了更好的理解細(xì)胞群體遷移的調(diào)控機(jī)制,我們決定選擇果蠅卵室發(fā)育過(guò)程中發(fā)生群體細(xì)胞遷移的邊界細(xì)胞團(tuán)作為研究對(duì)象,開(kāi)展相關(guān)研究,以期發(fā)現(xiàn)其中的一些共性,更好的闡明肝肺綜合征血管新生過(guò)程的具體機(jī)制。研究方法:1.構(gòu)建HPS大鼠模型,提取并鑒定血清外泌體,觀察PMVECs對(duì)其的吸收情況構(gòu)建運(yùn)用膽總管結(jié)扎術(shù)(CBDL)誘導(dǎo)的HPS大鼠模型,5周后進(jìn)行血?dú)狻⒏喂�、血流�?dòng)力學(xué)測(cè)定以及肝肺組織病理切片分析,取假手術(shù)組和HPS組大鼠外周動(dòng)脈血血清運(yùn)用差速離心法提取外泌體,運(yùn)用Western blot、TEM和NTA法鑒定外泌體,再用BCA測(cè)定外泌體濃度變化。最后,運(yùn)用PKH67標(biāo)記外泌體,與PMVECs共培養(yǎng),觀察對(duì)外泌體的吸收情況。2.觀察血清外泌體對(duì)PMVECs增殖、遷移及成管的影響將血清外泌體與PMVECs共培養(yǎng),通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期及增殖情況;運(yùn)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)觀察PMVECs的遷移情況;采用Matrial膠體外管腔形成法觀察成管能力的變化。3.利用miRNA生物芯片篩查外泌體miRNA差異表達(dá)譜,并進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證對(duì)大鼠外周血血清外泌體進(jìn)行miRNA生物芯片篩查,得到差異表達(dá)的miRNA,運(yùn)用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。4.觀察miR-194對(duì)PMVECs增殖、遷移及成管的影響將miR-194激動(dòng)劑和抑制劑轉(zhuǎn)染PMVECs,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期及增殖情況;運(yùn)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕試驗(yàn)觀察PMVECs的遷移情況;采用Matrial膠體外管腔形成法觀察成管能力的變化。5.生物信息學(xué)分析并驗(yàn)證潛在的miR-194靶基因運(yùn)用Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-194的靶基因,運(yùn)用Amigo數(shù)據(jù)庫(kù)搜集負(fù)調(diào)控血管生成的基因,取兩組數(shù)據(jù)的交集,得到miR-194潛在的調(diào)控血管生成的靶基因,運(yùn)用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。6.分析HPS時(shí)血清中增加的外泌體的分泌細(xì)胞對(duì)可能導(dǎo)致血清外泌體和外泌體內(nèi)miR-194增加的細(xì)胞進(jìn)行篩查,并模擬體內(nèi)條件運(yùn)用膽汁酸刺激篩查出的細(xì)胞,觀察其分泌外泌體和miR-194的變化7.在體和離體水平驗(yàn)證肝細(xì)胞內(nèi)P53通路介導(dǎo)的外泌體分泌在HPS血管生成中作用運(yùn)用P53抑制劑pifithrin-μ、P53 RNAi探討P53對(duì)膽汁酸處理后肝細(xì)胞中TASP6表達(dá)、培養(yǎng)基里外泌體濃度以及外泌體miR-194含量的影響。CBDL模型大鼠靜脈注射pifithrin-μ、GW4869或anta-miR-194,觀察其對(duì)肺血管生成及存活率的影響。進(jìn)一步分析了HPS患者和大鼠血清胞外泌體miR-194水平和P(A-a)O_2的相關(guān)性。8.在果蠅卵室內(nèi)利用活體成像和光遺傳學(xué)技術(shù),觀察Myo-II流動(dòng)在群體細(xì)胞遷移中的具體作用結(jié)果:1.成功構(gòu)建運(yùn)用膽總管結(jié)扎術(shù)(CBDL)誘導(dǎo)的HPS大鼠模型,并從外周血清中提取出外泌體,發(fā)現(xiàn)肝肺綜合征大鼠血清外泌體濃度存在顯著改變,PKH-67標(biāo)記的血清外泌體可以被PMVECs吸收。2.來(lái)源于肝肺綜合征大鼠血清的外泌體可以顯著促進(jìn)PMVECs的增殖、遷移及成管效應(yīng)。3.miRNA生物芯片及qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果提示miR-194在肝肺綜合征大鼠血清的外泌體內(nèi)表達(dá)顯著升高。4.miR-194可以顯著促進(jìn)PMVECs的增殖、遷移及成管效應(yīng)。5.miR-194發(fā)揮的促血管生成效應(yīng)可能是由其靶基因THBS1,STAT1和LIF介導(dǎo)的。6.膽汁酸刺激下,肝細(xì)胞分泌的外泌體和外泌體miR-194增加。7.膽汁酸刺激下,P53核轉(zhuǎn)位增加。pifithrin-μ和P53 RNAi均顯著抑制TASP6表達(dá)、下調(diào)培養(yǎng)基中外泌體濃度和外泌體miR-194水平。在體情況下,CBDL模型大鼠靜脈注射pifithrin-μ、GW4869或anta-miR-194治療后,血清外泌體濃度降低,外泌體源性miR-194水平也降低,肺血管生成減少,存活率提高。8.研究發(fā)現(xiàn)群體細(xì)胞遷移過(guò)程中存在兩種不同的Myo-II流,它們與E-鈣黏素偶聯(lián),控制著邊界細(xì)胞在護(hù)理細(xì)胞之間移動(dòng)時(shí)前端突起的生長(zhǎng)和后端細(xì)胞膜間的分離。前導(dǎo)細(xì)胞中Myo-II和E-鈣黏素的雙向流動(dòng)與突起的生長(zhǎng)和肌動(dòng)蛋白逆向流動(dòng)相關(guān),它們反過(guò)來(lái)控制突起的生長(zhǎng)和肌動(dòng)蛋白的極化。相反,在跟隨細(xì)胞中,單向脈沖式Myo-II和E-鈣黏素流促進(jìn)了其與護(hù)理細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)分離。結(jié)論:1.我們證明了肝肺綜合征大鼠血清外泌體miR-194介導(dǎo)肝細(xì)胞與PMVEC之間的串話,并有助于PMVEC增殖,遷移和管形形成。外泌體/miR-194軸在肺血管新生中起關(guān)鍵的病理作用。這些發(fā)現(xiàn)表明,外泌體可能是肝肺綜合征治療的一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。2.果蠅卵室邊界細(xì)胞群體遷移過(guò)程中獨(dú)特的Myo-II流動(dòng)作為一個(gè)關(guān)鍵的生物力學(xué)機(jī)制,控制多細(xì)胞環(huán)境里群體細(xì)胞遷移過(guò)程中前導(dǎo)細(xì)胞突起的生長(zhǎng)和跟隨細(xì)胞膜的分離。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R575;R563

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9 張憲法,葉玉生;83例肝肺綜合征臨床分析[J];重慶醫(yī)學(xué);1998年02期

10 葉玉生,張憲法;83例肝肺綜合征臨床分析[J];當(dāng)代醫(yī)師雜志;1997年12期

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8 王葉蒙;大鼠肝移植治療肝肺綜合征的初步研究[D];浙江大學(xué);2011年

9 張禮;肝肺綜合征[D];浙江大學(xué);2002年

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本文編號(hào)：2630789