【摘要】： 目的為了研究TLR3在人類胎盤HBV感染中的作用,本課題采用人群研究和體外實驗相結(jié)合的方法,從基因和蛋白水平初步了解正常孕婦人群與HBsAg陽性孕婦人群胎盤組織TLR3的表達和分布情況以及與HBV宮內(nèi)感染的關(guān)系,根據(jù)人群研究提供的線索進一步進行體外實驗,探索TLR3在胎盤細胞抵御HBV感染中的作用。 ①了解TLR3受體在正常孕婦和HBsAg陽性孕婦胎盤組織的基因表達及蛋白分布情況; ②了解胎盤組織TLR3 mRNA表達與孕婦HBV感染的關(guān)系;從基因水平了解胎盤組織TLR3 mRNA與孕婦外周血HBV DNA含量的關(guān)系以及與新生兒HBV宮內(nèi)感染的關(guān)系;從蛋白水平了解TLR3與胎盤HBV感染的關(guān)系及與新生兒HBV宮內(nèi)感染的關(guān)系; ③研究HBV感染對人胎盤滋養(yǎng)層細胞系Bewo中TLR3 mRNA表達的影響,觀察人胎盤滋養(yǎng)層細胞系Bewo中TLR3抗HBV感染的生物學(xué)作用。 方法①普通半定量RT-PCR和Real time RT-PCR檢測正常孕婦和HBsAg陽性孕婦胎盤組織TLR3 mRNA的表達情況,免疫組織化學(xué)ABC法檢測正常孕婦和HBsAg陽性孕婦胎盤組織TLR3分布情況: ②熒光定量PCR檢測HBsAg陽性孕婦及其新生兒HBV DNA含量: ③建立HBV體外感染人胎盤滋養(yǎng)層細胞模型;高濃度HBV DNA陽性血清與Bewo細胞共培養(yǎng),熒光定量PCR法檢測培養(yǎng)上清中HBV DNA含量:免疫組織化學(xué)ABC法檢測細胞爬片Bewo細胞中HBsAg: ④普通半定量RT-PCR和Real time RT-PCR檢測人胎盤滋養(yǎng)層細胞系Bewo中TLR3mRNA的表達;HBV感染前后人胎盤滋養(yǎng)層細胞系Bewo中TLR3 mRNA表達的變化;利用PolyI:C刺激Bewo細胞TLR3 mRNA的表達,設(shè)計合成特異的siRNA阻抑Bewo細胞TLR3 mRNA的表達,同時設(shè)對照組,Real time RT-PCR檢測三組細胞經(jīng)不同措施干預(yù)后TLR3 mRNA的表達變化,同時檢測用10~8copies/ml濃度的HBV DNA陽性血清與上述三組細胞共同培養(yǎng)后上清液中HBV DNA含量的變化。 結(jié)果①半定量RT-PCR和Real time RT-PCR結(jié)果均顯示nBsAg陽性孕婦胎盤組織TLR3mRNA含量低于正常孕婦胎盤組織(t=3.003,P＜0.05;t=4.698,P＜0.05);免疫組化檢測41例正常孕婦胎盤TLR3全部陽性,且各層細胞均顯示很強的免疫印跡,呈片狀分布;所檢116例外周血HBsAg陽性孕婦胎盤組織中73.0%TLR3受體陽性,棕黃色信號局灶性分布于被檢胎盤的各型細胞中;TLR3在兩組的胎盤分布經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗差異有顯著性(Fisher's確切概率P＜0.01); ②胎盤組織TLR3 mRNA水平與孕婦外周血HBV DNA含量無關(guān)(F=0.147,P＞0.05);胎盤組織TLR3 mRNA水平與新生兒宮內(nèi)感染無關(guān)(t=0.888,P＞0.05); ③從蛋白水平研究TLR3與胎盤HBV感染及與新生兒HBV宮內(nèi)感染的關(guān)系,結(jié)果顯示TLR3陽性不僅是胎盤HBV感染的保護因素(OR=0.259,0.189～0.354),同時也是新生兒HBV宮內(nèi)感染的保護因素(OR=0.438,0.204～0.942)之一。 ④HBV DNA陽性血清與Bewo細胞共培養(yǎng)24小時組、48小時組,在細胞感染后不同時段(24小時、48小時、72小時)的培養(yǎng)上清中均可檢出HBV DNA;免疫組織化學(xué)ABC法檢測細胞爬片Bewo細胞內(nèi)HBsAg的表達,陽性物質(zhì)呈細小棕黃色顆粒,多數(shù)呈胞漿均質(zhì)型,少數(shù)呈胞漿不均質(zhì)型,少數(shù)細胞核內(nèi)亦可見陽性表達。光鏡下HBsng陽性細胞未見形態(tài)學(xué)上的明顯變化。 ⑤經(jīng)普通半定量RT-PCR和Real time RT-PCR檢測證實人胎盤滋養(yǎng)層細胞系Bewo中TLR3 mRNA的表達呈陽性;HBV感染Bewo細胞后TLR3 mRNA表達高于對照組(t=4.479,P＜0.05);PolyI:C刺激Bewo細胞后TLR3 mRNA的表達水平高于siRNA組和對照組(H=13.087,P＜0.05;H=13.100,P＜0.017),siRNA組和對照組細胞TLR3 mRNA含量無差別(H=3.287,P＞0.05);用10~8copies/ml濃度的HBV DNA陽性血清與上述三組細胞共同培養(yǎng)后,三組均可檢出HBV DNA,PolyI:C組上清中HBV DNA含量低于siRNA組和對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.531,P＜0.05);siRNA組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD檢驗P＞0.05)。 結(jié)論①胎盤組織TLR3表達情況與孕婦乙型肝炎病毒感染有關(guān),TLR3高表達是孕婦乙型肝炎病毒感染的保護因素; ②蛋白水平的檢測結(jié)果顯示,HBsAg陽性孕婦胎盤組織TLR3陽性率低于正常孕婦胎盤組織,TLR3是孕婦胎盤HBV感染的保護因素,同時也是HBV宮內(nèi)感染的保護因素; ③乙型肝炎病毒可在體外成功感染人胎盤滋養(yǎng)層細胞系Bewo;體外培養(yǎng)的人胎盤滋養(yǎng)層細胞系Bewo可穩(wěn)定表達TLR3,也可被乙型肝炎病毒直接感染,故此模型可作為研究HBV胎盤感染機制的良好工具: ④Bewo細胞受HBV感染后TLR3 mRNA表達上調(diào);PolyI:C刺激可使Bewo細胞TLR3 mRNA表達上調(diào),抗乙型肝炎病毒能力增強。 ⑤研究結(jié)果表明HBV感染與人體初始免疫有關(guān),TLR3在胎盤細胞抵御HBV感染中發(fā)揮重要生物學(xué)作用,TLR3為胎盤HBV感染及新生幾HBV宮內(nèi)感染的保護因素,人群研究和體外實驗結(jié)果基本一致,該研究結(jié)果將為乙肝防治和HBV宮內(nèi)感染的預(yù)防及治療提供新思路。
【圖文】：

.3.2半定量盯一pcR技術(shù)檢測胎盤組織 TLR3mRNA的表達情況用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Rl’ -pCR)技術(shù)檢測HBsAg陽性孕婦和正常孕婦胎盤組織 TLR3n1RNA的表達情況，結(jié)果見表1一3和圖1一1。HBsAg陽性孕婦組TLR3吸光度比值(TLR3/p一aetin)均數(shù)為0.4175士0.2216，，正常孕婦組為0.6387士0.2053，兩組資料符合正態(tài)性和方差齊性。 TLR3n1RNA在HBsAg陽性孕婦組的表達低于正常孕婦組(t=3.003，p (0.05)。表1一3半定量RT-PCR技術(shù)檢測胎盤組織 TLR3mRNA的表達分組例數(shù)吸光度t匕值TLR3/p一aetinHBsAg陽性孕婦組正常孕婦組1422 0.4175士0.2216 0.6387士0.2053拼 3.003，尸=0005圖1一 1:TLR3RT一pCR產(chǎn)物1.7%瓊脂糖凝膠電泳圖 M:PCRMarker:日一 aetin，從上至下依次為:600bp、SOObp、400bp、300bp、ZOObp、10Obp(285bp)2:TLR3(477bD)

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【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R512.62;R714.2

【參考文獻】

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本文編號：2630707