【摘要】：目的：1.探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BM MSCs)對(duì)體內(nèi)外活化T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。2,探討血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)修飾的BM MSCs (HO-1/MSCs)及BM MSCs在單層腸上皮細(xì)胞環(huán)境中產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)及其機(jī)制。3.初步探討HO-1/MSCs及BM MSCs在腸缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制。 方法：1.取4-5周齡健康、雄性Wistar大鼠,采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法分離培養(yǎng)BM MSCs,流式細(xì)胞術(shù)鑒定第3代細(xì)胞的表型。2.建立體外共培養(yǎng)模型：采用混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),在6孔板加入CaCo-2細(xì)胞建立單層腸上皮環(huán)境模型,將BM MSCs及HO-1/MSCs消化計(jì)數(shù),每孔加入2×105個(gè)/mL,大鼠新鮮懸浮脾淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)每孔加入1×106個(gè)/mL,在除外空白組的各組加入10μg/mL的刀豆蛋白A(ConA)以刺激T淋巴細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)分3個(gè)時(shí)間點(diǎn)：分別為0、24、48h,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)7組,實(shí)驗(yàn)組(脾淋巴細(xì)胞、HO-1/MSCs、CaCo-2、ConA)、對(duì)照組A(脾淋巴細(xì)胞、BM MSCs、CaCo-2、ConA),對(duì)照組B(脾淋巴細(xì)胞、CaCo-2、ConA),對(duì)照組C(脾淋巴細(xì)胞、HO-1、MSCs、ConA),對(duì)照組D(脾淋巴細(xì)胞、BM MSCs、 ConA),增殖組(脾淋巴細(xì)胞、ConA),空白組(脾淋巴細(xì)胞)。MTT檢測(cè)T淋巴細(xì)胞活性,ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α、IL-10及TGF-1β水平,流式檢測(cè)Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)率。3.模擬小腸移植腸缺血時(shí)間建立大鼠體內(nèi)腸道缺血再灌注損傷環(huán)境模型：取6-8周齡健康、雄性Wistar大鼠,術(shù)前均禁食12h,于無(wú)菌環(huán)境下分離大鼠的腸系膜上動(dòng)脈,夾閉40min后松開(kāi)血管夾,注射單細(xì)胞懸液或者相同劑量的生理鹽水,關(guān)腹,建立腸缺血再灌注損傷模型。4.將模型組分4組：實(shí)驗(yàn)組(lml HO-1/MSCs細(xì)胞經(jīng)腸黏膜下植入)和BM MSCs對(duì)照組(lml BM MSCs細(xì)胞經(jīng)腸黏膜下植入),生理鹽水對(duì)照組(1ml生理鹽水經(jīng)腸黏膜下植入),假處理組(開(kāi)腹后不做任何處理,40min后關(guān)腹),各組分別于術(shù)后24h處死大鼠,留取動(dòng)物血清和小腸組織標(biāo)本備用；5.采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)TNF-α的水平及免疫調(diào)節(jié)因子IL-10及TGF-1β水平；光鏡下觀察小腸組織的病理變化。 結(jié)果：1.體外成功分離培養(yǎng)出BM MSCs,經(jīng)流式鑒定第3代貼壁細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CD29、CD90及RT1A均達(dá)90%以上,載有HO-1的腺病毒轉(zhuǎn)染第3代BM MSCs成功率達(dá)80%以上。2.成功建立大鼠體外腸道環(huán)境共培養(yǎng)模型：①M(fèi)TT檢測(cè)脾臟T淋巴細(xì)胞0h、24h、48h活性,經(jīng)LOG10轉(zhuǎn)換后,實(shí)驗(yàn)組24h、48h分別為-0.447±0.067、-0.455±0.027, BM MSCs對(duì)照組為-0.321±0.028、-0.323±0.026,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。②ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-10, TGF-1β水平,TNF-α、IL-10、 TGF-1β水平Oh實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)差別,分別為69.865±18.953、275.92±9.714、275.92±9.714, BM MSCs對(duì)照組24h、48hTNF-α水平為95.737±5.981、96.471±7.863,實(shí)驗(yàn)組為57.444±18.41、63±8.718；BM MSCs對(duì)照組IL-10水平24h、48h為404.949±10.181、366.016±5.18,實(shí)驗(yàn)組為586.154±15.783、638.718±41.154；BM MSCs對(duì)照組TGF-1β水平24h、48h為441.27±12.716、433.231±29.224,實(shí)驗(yàn)組為522.285±25.686、501.123±11.609；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。③流式細(xì)胞儀檢測(cè)T調(diào)節(jié)細(xì)胞表達(dá)率,其中24h、48h實(shí)驗(yàn)組FoxP3+T調(diào)節(jié)細(xì)胞表達(dá)率均高于對(duì)照組,分別為實(shí)驗(yàn)組8.1%、8.6%,BM MSCs對(duì)照組0.2%、0.1%。3.模擬小腸移植腸缺血時(shí)間點(diǎn),成功建立大鼠體內(nèi)腸缺血再灌注損傷模型,①ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-10, TGF-1β水平,其中BM MSCs對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組TNF-α水平24h分別為51.877±2.2、31.827±4.681,TGF-1β水平24h分別為748.79±87.943、1097.566±198.582,IL-10水平24h分別為995.956±57.057、1357.963±115.003。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。②形態(tài)學(xué)方面：BM MSCs對(duì)照組24h小腸組織HE染色顯示：小腸絨毛水腫、腸上皮細(xì)胞壞死、腸道間質(zhì)充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度與同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組相比明顯較重。 結(jié)論：1.密度梯度離心聯(lián)合貼壁法方法簡(jiǎn)單、可以大量體外擴(kuò)增BM MSCs,純度較高。2.在體外共培養(yǎng)腸上皮環(huán)境下,BM MSCs可以通過(guò)抑制炎性因子TNF-α的表達(dá)及促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)因子TGF-1β IL-10及T調(diào)節(jié)細(xì)胞的表達(dá)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,這一免疫調(diào)節(jié)作用的發(fā)揮可以被成功載入的HO-1所放大。3.在腸缺血再灌注損傷模型中,BM MSCs可以明顯修復(fù)小腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)、減輕小腸通透性,因此BM MSCs對(duì)大鼠腸缺血-再灌注損傷具有保護(hù)作用,HO-1/MSCs中載入的HO-1可放大這一保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R574.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2630483