【摘要】：研究背景:膽汁淤積(cholestasis)是一種由于多種原因?qū)е碌哪懰帷⒛懠t素等排泄物不能從肝臟正常排出,進(jìn)而導(dǎo)致肝臟膽酸水平升高而引起的一系列病癥的消化系統(tǒng)疾病。膽汁淤積早期,肝臟會產(chǎn)生一系列適應(yīng)性反應(yīng),以保護(hù)肝臟,主要包括:降低肝內(nèi)膽汁酸的合成、減少膽汁酸的攝取、促進(jìn)膽汁酸的外排以及增高肝臟解毒酶的活性等。若病變超出肝臟適應(yīng)性反應(yīng)代償范圍,可造成肝損傷、肝纖維化,甚至肝硬化等。膽酸等化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)主要依靠肝細(xì)胞膜上的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,主要包括NTCP(Na~+-taurocholate cotransporting polypeptide)、MRPs(multidrug resistance-associated proteins)以及OATPs(organic-anion-transporting polypeptides)等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。目前研究發(fā)現(xiàn)人體中存在11種OATPs轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其中OATP1A2,OATP1B1,OATP1B3和OATP2B1研究較多。有研究發(fā)現(xiàn),在人膽汁淤積肝臟中,OATP1B1和OATP1B3顯著降低,可以顯著減少肝細(xì)胞對膽汁酸的攝取,減輕膽酸在肝細(xì)胞內(nèi)的聚積,從而保護(hù)肝臟。OATP3A1位于肝細(xì)胞基底外側(cè)膜,其轉(zhuǎn)運(yùn)底物主要包括膽汁酸、膽紅素等化合物。研究表明,OATP3A1在膽汁淤積中表達(dá)升高,具有促進(jìn)肝內(nèi)膽汁酸排出和保護(hù)肝臟的作用。膽固醇7α-羥化酶(Cholesterol 7 alpha-hydroxylase,CYP7A1)是膽汁酸合成的主要限速酶,可將膽固醇轉(zhuǎn)換為膽汁酸。研究報道,CYP7A1在酒精性肝病和膽汁淤積患者中受到顯著抑制,進(jìn)而降低肝內(nèi)膽汁酸的合成,從而減少膽酸對肝細(xì)胞的損傷。肝受體同源物-1(liver receptor homolog-1,LRH-1)是一種核受體,由NR5A2基因編碼,主要在肝臟,腸道和胰腺中表達(dá)。LRH-1可促進(jìn)CYP7A1和CYP8B1轉(zhuǎn)錄,并參與膽汁酸穩(wěn)態(tài)和膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種短鏈非編碼RNA,可通過與下游靶基因3’UTR區(qū)域結(jié)合從而降解靶基因,調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。miR-200家族廣泛存在于人體的各個組織中,研究較為廣泛,參與多種生物學(xué)活動的過程,主要包括miR-200a,miR-200b,miR-200c,miR-141以及miR-429等,miR-200b在細(xì)胞中分解為miR-200b-3p和miR-200b-5p,進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。以往對miR-200b-3p的研究較少,前期我們通過膽汁淤積人肝組織miRNA基因芯片篩查,發(fā)現(xiàn)miR-200b-3p表達(dá)顯著升高,在人肝組織中尚未得到驗(yàn)證,同時miR-200b-3p與OATPs和膽汁酸合成酶之間是否存在相關(guān)關(guān)系,目前尚不清楚,本研究通過收集35例人體組織標(biāo)本,對患者miR-200b-3p的表達(dá)及其與OATPs和膽汁酸合成酶之間的關(guān)系進(jìn)行探討。研究方法:1.收集35例在我院肝膽外科行肝臟手術(shù)的患者肝組織樣品,其中阻塞性膽汁淤積患者24例,正常對照組患者11例,所有手術(shù)取到的肝臟樣品立即切成約30mg的小塊,裝在凍存管內(nèi),放入液氮罐內(nèi)保存,用時取出適量肝組織。2.通過酶標(biāo)法檢測所有入組患者的肝功能,主要觀察包括:AST,ALT,ALP,GGT,TBIL,DBIL,IBIL以及TBA等指標(biāo)。3.通過膽汁淤積患者與正常對照患者組織進(jìn)行3x3的miRNA芯片檢測,發(fā)現(xiàn)差異較為顯著的相關(guān)miRNAs,并采用實(shí)時定量PCR檢測阻塞性膽汁淤積和正常對照組的miR-200b-3p、miR-4665-5P、miR-363-5p及miR-3609等基因的mRNA表達(dá)水平。4.MiR-200b-3p與肝功能指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。5.檢測人肝組織中膽汁酸代謝相關(guān)基因LRH-1,CYP7A1及CYP8B1等表達(dá)。6.采用50ng/mL的FGF19,TNF-α,IL-1β,IL-8,IP-10,HGF及TWEAK等因子處理HepG2細(xì)胞12h,采用0、5、25、50 ng/mL的FGF19處理HepG2細(xì)胞12h,采用50ng/mL FGF19分別處理0、1、3、6、12和24h。提取細(xì)胞總RNA,檢測miR-200b-3p表達(dá)。探討誘導(dǎo)調(diào)控miR-200b-3p表達(dá)的因子。7.采用miR-200b-3p mimics轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞24h后,分別提取細(xì)胞總RNA和總蛋白,采用RT-PCR檢測miR-200b-3p表達(dá),確認(rèn)其轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。采用RT-PCR檢測膽汁酸合成相關(guān)酶(CYP7A1,CYP7B1,CYP8B1,CYP27A1)、核受體(LRH-1,FXR,HNF4α,HNF1α,SHP)、肝臟解毒酶(GSTM1-4,GSTA1-4,CYP3A4,UGT2B4,UGT2B7,SULT2A1)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MRP2,MRP3,OSTα,OSTβ,OATP3A1)等基因的mRNA表達(dá)水平。通過Western Blot檢測LRH-1,CYP7A1,CYP8B1,MRP3以及OATP3A1等基因的蛋白表達(dá)水平。8.采用miR-200b-3p mimics轉(zhuǎn)染PLC5細(xì)胞24h后,分別提取細(xì)胞總RNA和總蛋白,采用RT-PCR檢測miR-200b-3p和OATP3A1的mRNA表達(dá)水平,通過Western Blot檢測OATP3A1的蛋白表達(dá)水平。9.采用miR-200b-3p inhibitor轉(zhuǎn)染HepG2和PLC5細(xì)胞24h后,分別提取細(xì)胞總RNA和總蛋白,采用RT-PCR檢測miR-200b-3p和OATP3A1的mRNA表達(dá)水平,通過Western Blot檢測OATP3A1的蛋白表達(dá)水平。10.預(yù)測、設(shè)計并合成miR-200b-3p與LRH-1結(jié)合的野生序列(LRH-1-wt)和突變序列(LRH-1-mut)到pmirGLO質(zhì)粒中,同采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)(luciferase reporter gene assay)檢測兩種熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.阻塞性膽汁淤積患者的AST、ALT、ALP、GGT、TBIL、DBIL、IBIL及TBA等血液肝功能指標(biāo)均明顯高于正常對照組患者(P0.05)。2.實(shí)時定量PCR證實(shí):在阻塞性膽汁淤積組患者肝臟中miRNA-200b-3p表達(dá)量是正常對照組患者肝組織樣品的1.8倍(P0.05)。3.在miRNA-200b-3p表達(dá)高組中,患者TBA降低,且兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P0.05),與其他肝功能指標(biāo)無明顯相關(guān)性(P0.05)。4.膽汁淤積性肝組織中,LRH-1和CYP8B1顯著上調(diào),而CYP7A1顯著下調(diào)。在miR-200b-3p高表達(dá)組中,LRH-1和CYP8B1顯著低于miR-200b-3p低表達(dá)組(P0.05);CYP7A1顯著低于對照組(P0.05);且miR-200b-3p與LRH-1和CYP8B1呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。5.FGF19可誘導(dǎo)miR-200b-3p升高2.6倍(P0.01),且呈顯著的時間和量效依賴關(guān)系(P0.01),其他IL-1β、IL-8、IP-10、TNF-α、HGF、TWEAK等因子對miR-200b-3p影響無明顯差異(P0.05)。6.miR-200b-3p mimics轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞,24h后提取總RNA和總蛋白,miR-200b-3p表達(dá)量顯著升高(P0.01),LRH-1、CYP7A1及CYP8B1的表達(dá)顯著降低(P0.05),OATP3A1表達(dá)顯著升高(P0.05)。7.miR-200b-3p mimics轉(zhuǎn)染到PLC5細(xì)胞,24h后提取總RNA和總蛋白,miR-200b-3p表達(dá)量顯著升高(P0.01),OATP3A1表達(dá)顯著升高(P0.05)。8.miR-200b-3p inhibitor轉(zhuǎn)染到HepG2和PLC5細(xì)胞,24h后提取總RNA和總蛋白,miR-200b-3p表達(dá)顯著降低(P0.05),OATP3A1表達(dá)顯著降低(P0.05)。9.熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)顯示:pmirGLO-LRH-1 wt和miR-200b-3p mimics共同轉(zhuǎn)染組的熒光素酶的相對活性顯著下降(P0.05),此外,在pmirGLO-LRH-1 mut組中,熒光素酶的相對活性顯著上升至正常(P0.05),提示miR-200b-3p可與LRH-1相結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:1.在阻塞性膽汁淤積人肝組織中,miR-200b-3p表達(dá)顯著升高,通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)miR-200b-3p與TBA呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,提示其可能參與膽汁酸的代謝及轉(zhuǎn)運(yùn);2.細(xì)胞因子FGF19可誘導(dǎo)miR-200b-3p表達(dá)升高,且具有時間和量效依賴關(guān)系;3.miR-200b-3p可能是通過抑制核受體LRH-1的表達(dá),進(jìn)而下調(diào)膽汁酸合成酶CYP7A1和CYP8B1的表達(dá),從而減少肝內(nèi)膽汁酸合成;同時,miR-200b-3p可間接上調(diào)OATP3A1的表達(dá),增加膽汁酸外排,從而在一定程度上減輕肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸的蓄積,起到保護(hù)肝細(xì)胞的作用。
【圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文NAs 的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阻塞性膽汁淤積組患者b-3p 是正常對照組的 1.8 倍（圖 1，P＜0.05），然而，兩組患5-5p、miRNA-363-5p 以及 miRNA-3609 差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意研究探討 miRNA-200b-3p 在阻塞性膽汁淤積患者中的作用，b-3p 與肝功能指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。

圖 2. miRNA-200b-3p 高表達(dá)組和低表達(dá)組的肝功能比較.4 在 miRNA-200b-3p 高表達(dá)組中，miRNA-200b-3p 與 TBA 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系探討 miRNA-200b-3p 在阻塞性膽汁淤積患者中的作用，將其相對表達(dá)量與指標(biāo)進(jìn)行 Pearson 相關(guān)性分析。結(jié)果表明，，在 miRNA-200b-3p 高表達(dá)組0b-3p 與 TBA 呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖 2，P＜0.05)，與其他肝功能指標(biāo)無(圖 2，P＞0.05)。上述結(jié)果提示 miR-200b-3p 可能參與了膽汁酸的代謝過制和降低膽汁酸水平的作用，其具體機(jī)制目前尚不清楚。此外，miR-200性膽汁淤積患者中受到何種因子的調(diào)控和影響，目前均尚不清楚。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575

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本文編號：2630295