【摘要】：【研究背景及目的】 肝硬化(liver cirrhosis)是肝纖維化發(fā)展的晚期階段。在其形成過程中,纖維化程度逐漸加深,在肝組織中形成以纖維包繞的異常肝細(xì)胞結(jié)節(jié)(假小葉)。目前研究已充分表明,肝纖維化是一個(gè)動(dòng)態(tài)的可逆的過程,也有研究認(rèn)為在人類和動(dòng)物模型中肝硬化可發(fā)生逆轉(zhuǎn),但其能否出現(xiàn)完全逆轉(zhuǎn)仍有較大爭議。 肝細(xì)胞核因子4(hepatocyte nuclear factor, HNF4)是一種屬于細(xì)胞核激素受體家族的轉(zhuǎn)錄因子,在分化成熟的肝細(xì)胞中高表達(dá)。其中HNF4α是HNF4重要亞型。HNF4α參與維護(hù)肝細(xì)胞白蛋白合成、藥物解毒、能量代謝、膽汁酸合成和脂肪代謝等重要功能,也是調(diào)控上皮細(xì)胞表型(如緊密連接、粘附連接、縫隙連接、橋粒以及細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間粘附分子、上皮細(xì)胞極性和細(xì)胞骨架蛋白等)表達(dá)的重要基因。本研究旨在探討HNF4α對大鼠肝硬化的治療效果及其機(jī)制。 【實(shí)驗(yàn)方法】 一、重組復(fù)制缺陷型腺病毒AdHNF4α擴(kuò)增 利用本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的表達(dá)HNF4α的重組腺病毒載體AdHNF4α,293細(xì)胞反復(fù)感染,擴(kuò)增高效表達(dá)HNF4α的AdHNF4α和空白對照病毒AdGFP,濃縮純化、測定滴度后保存。 二、AdHNF4α治療實(shí)驗(yàn)性肝硬化 將雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為4組,每組8只。第1組為正常對照組;第2~4組予硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)溶液按0.2 g/kg體重腹腔注射。每周注射3次,隔天1次,連續(xù)注射15w,制備TAA誘導(dǎo)的大鼠早期肝硬化模型。以同樣方式連續(xù)注射18周,制備TAA誘導(dǎo)的大鼠晚期肝硬化模型。 模型制備完成后,第2組設(shè)為模型對照組,第3組設(shè)為病毒對照組,第4組設(shè)為AdHNF4α導(dǎo)入組。于TAA注射完畢后的三周內(nèi)分別經(jīng)尾靜脈注入5×10~9 pfu/只AdGFP或5×10~9 pfu/只AdHNF4α,每周2次,共注射6次。 末次注射病毒后2周處死所有大鼠,分別觀察各組大鼠肝臟大體變化;HE、Masson’s trichrome和Sirius Red染色觀察病理變化,檢測ECM含量;堿水解法檢測各組肝組織羥脯氨酸含量;Real time PCR檢測肝臟Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達(dá);Real time PCR檢測白蛋白(albumin,ALB)、谷胺酰氨合成酶(glutamine synthetase,GS)、細(xì)胞色素P450家族1A2(cytochrome P450 1A2,CYP1A2)肝細(xì)胞功能基因的表達(dá);免疫組織化學(xué)方法分別檢測HNF4α、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1(Fibroblast specific Protein-1,FSP1)等肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。 三、AdHNF4α對肝細(xì)胞BRL-3A和HSC-T6生物學(xué)特性的影響 分別用AdGFP或AdHNF4α感染大鼠肝細(xì)胞株BRL-3A(MOI=100)和大鼠肝活化星狀細(xì)胞株HSC-T6(MOI=1200),收集感染后72 h細(xì)胞,抽提總RNA及蛋白。Real time PCR和Western blot法檢測HNF4α表達(dá),同時(shí)測定Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原等肝纖維化相關(guān)基因的mRNA量。 四、探討HNF4α治療實(shí)驗(yàn)性肝硬化機(jī)制 (一)將病毒感染BRL-3A和HSC-T6,Real time PCR和Western blot法檢測細(xì)胞HNF4α、肝纖維化相關(guān)基因、ERK通路相關(guān)基因、組織金屬蛋白酶抑制-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1 )及基質(zhì)金屬蛋白酶類( matrix metalloproteinases , MMPs)表達(dá)變化。 (二)Real time PCR檢測大鼠肝組織標(biāo)本中ERK通路相關(guān)基因MEK1、ERK1、ELK1和纖維溶解系統(tǒng)基因TIMP-1、MMPs表達(dá)。免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠肝組織標(biāo)本中HNF4α、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JunD、JunD、TIMP-1、MMP9、MMP13等蛋白的表達(dá)。 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,結(jié)果以(X|—)±S表示。多組間采用One-Way ANOVA分析,方差齊性則采用非參數(shù)檢驗(yàn);P 0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】 一、HNF4α治療實(shí)驗(yàn)性大鼠肝硬化 (一)成功建立TAA誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝硬化模型 TAA注射15周后,大鼠肝臟硬度增加,表面呈顆粒狀或結(jié)節(jié)狀。病理檢查顯示,肝細(xì)胞變性、壞死,以小葉周邊更為顯著,匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤及纖維組織增生,肝內(nèi)廣泛假小葉形成,假小葉內(nèi)可見纖維再分隔現(xiàn)象,并伴有明顯的肝細(xì)胞再生結(jié)節(jié),表明成功制備實(shí)驗(yàn)性早期肝硬化模型。TAA注射18周后,大鼠肝臟硬度增加,表面呈顆粒狀或結(jié)節(jié)狀,并且有大量腹水形成,病理檢查顯示肝硬化程度加深,表明大鼠已進(jìn)入晚期肝硬化。 (二)肝硬化形成過程中HNF4α表達(dá)逐漸下降 Real time PCR和免疫組織化學(xué)檢測顯示,伴隨著肝硬化的發(fā)展,HNF4α的表達(dá)明顯下調(diào);AdHNF4α導(dǎo)入后大鼠肝組織大量表達(dá)HNF4α(P0.05)。 (三)HNF4α逆轉(zhuǎn)大鼠早期肝硬化 大鼠肝硬化形成早期(15周),通過尾靜脈注射AdHNF4α或AdGFP。AdHNF4α治療組大鼠肝臟質(zhì)地柔軟,表面較光滑。HE、Masson和Sirius Red染色顯示HNF4α治療組大鼠肝臟硬化程度明顯減輕,假小葉結(jié)構(gòu)消失,提示HNF4α可逆轉(zhuǎn)早期肝硬化。模型對照組和AdGFP組羥脯氨酸含量分別為327.37±27.43μg/g和338.1±39.57μg/g,相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);AdHNF4α治療組羥脯氨酸含量為252.65±19.93μg/g,較上述兩個(gè)對照組明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。分析軟件結(jié)果顯示,AdHNF4α組膠原染色面積約為AdGFP組的32%(P0.05)。Real time PCR檢測提示AdHNF4α治療組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原較AdGFP組表達(dá)降低(P0.05)。 (四)HNF4α保護(hù)大鼠肝功能 血清生化檢測顯示,AdHNF4α治療后ALT、AST分別為59.3±2.52U/L、142±7 U/L,與AdGFP組(71±4.58 U/L、176.3±7.5U/L)比較明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Real time PCR結(jié)果顯示,AdHNF4α治療后肝組織肝功能相關(guān)基因ALB、GS和CYP1A2表達(dá)較AdGFP對照組升高(P0.05)。 (五)HNF4α抑制大鼠肝纖維化相關(guān)基因表達(dá) 免疫組織化學(xué)檢測提示,AdHNF4α治療組肝纖維化相關(guān)基因:α-SMA、FSP1和TGF-?1表達(dá)較AdGFP對照組明顯降低(P0.05)。 (六)HNF4α減輕晚期肝硬化大鼠肝纖維化 大鼠肝硬化形成晚期(18周),通過尾靜脈注射AdHNF4α或AdGFP。AdHNF4α治療組大鼠肝臟表面仍然呈顆粒狀或結(jié)節(jié)狀。HE、Masson和Sirius Red染色顯示HNF4α治療組大鼠肝臟纖維化程度較AdGFP對照組減輕(P0.05)。但病理檢查顯示,肝內(nèi)仍存在假小葉。提示HNF4α僅可減輕晚期肝硬化纖維化程度,而不能逆轉(zhuǎn)其肝硬化。 二、HNF4α抑制ERK通路的活性 (一)HNF4α抑制大鼠肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞株ERK通路活性 AdHNF4α感染肝細(xì)胞株BRL-3A和HSC-T6細(xì)胞72 h后,Real time PCR檢測顯示,AdHNF4α治療組ERK1以及其下游基因ELK1表達(dá)較AdGFP對照組明顯降低(P0.05),而ERK1上游基因MER1表達(dá)呈負(fù)反饋性上調(diào)(P0.05)。Western blot法發(fā)現(xiàn),AdHNF4α治療組HSC-T6細(xì)胞p-ERK、p-JunD表達(dá)較AdGFP對照組明顯降低,而ERK1/2、JunD的表達(dá)較對照組未見明顯差異。 (二)HNF4α抑制實(shí)驗(yàn)性肝硬化大鼠肝臟ERK通路活性 Real time PCR檢測顯示,AdHNF4α組肝組織ERK1及其下游基因ELK1表達(dá)較對照組明顯降低(P0.05),ERK1上游基因MER1表達(dá)略增加(P0.05)。免疫組織化學(xué)檢測提示AdHNF4α治療組肝臟p-ERK、ERK1/2及其調(diào)控的p-JunD、JunD表達(dá)較AdGFP對照組明顯減少。 三、HNF4α調(diào)節(jié)纖維溶解系統(tǒng)的平衡 (一)HNF4α調(diào)節(jié)大鼠肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞株TIMP-1、MMPs的表達(dá) AdHNF4α感染BRL-3A、HSC-T6細(xì)胞72 h后,Real time PCR檢測顯示TIMP-1表達(dá)較AdGFP對照組明顯降低(P0.05),MMP2、MMP9和MMP13的表達(dá)上調(diào)(P0.05)。Western blot法結(jié)果顯示AdHNF4α治療組HSC-T6細(xì)胞TIMP-1表達(dá)較AdGFP對照組明顯降低。AdHNF4α作用停止后,HSC-T6的TIMP-1表達(dá)隨之升高。 (二)HNF4α調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性肝硬化大鼠肝臟TIMP-1、MMPs表達(dá) Real time PCR檢測顯示AdHNF4α治療組TIMP-1表達(dá)較AdGFP對照組明顯降低(P0.05),MMP2的表達(dá)略升高(P0.05),而MMP9、MMP13的表達(dá)較對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。免疫組織化學(xué)檢測提示,伴隨肝硬化逆轉(zhuǎn),成纖維細(xì)胞減少,AdHNF4α治療組TIMP-1表達(dá)較AdGFP對照組降低,MMP2、MMP9和MMP13分泌較AdGFP對照組減少。 【結(jié)論】 一、肝硬化進(jìn)程中,肝細(xì)胞HNF4α表達(dá)逐漸降低。 二、AdHNF4α體內(nèi)導(dǎo)入可逆轉(zhuǎn)早期肝硬化,促進(jìn)肝功能恢復(fù),是治療實(shí)驗(yàn)性肝硬化新的有效方法。但是不能完全逆轉(zhuǎn)晚期肝硬化。 三、HNF4α逆轉(zhuǎn)肝硬化機(jī)制與下調(diào)ERK通路活性和調(diào)節(jié)TIMP-1/ MMPs平衡有關(guān)。
【圖文】：

將 25 μl 病毒與 475 μl TE 液充分混勻，13,000 rpm 離心 5 min，分光 OD260值，病毒滴度 pfu/ml=OD260×1012。三）肝硬化化動(dòng)物模型制備1．TAA 損傷早期肝硬化模型將雄性 SD 大鼠隨機(jī)分為 4 組，每組 8 只，第 1 組為正常對照組，2~ 按 0.2 g/kg 劑量腹腔注射。每周注射 3 次，隔天注射，連續(xù)注射 15A 誘導(dǎo)的大鼠早期肝硬化模型。其中第 2 組設(shè)為 Model 組，第 3 組為 組，第 4 組為 AdHNF4α 治療組。末次 TAA 注射后 1 周，分別經(jīng)尾109pfu/只 AdGFP 或 5×109pfu/只 AdHNF4α，每周兩次，共三周（圖 1 w 處死大鼠，取相同部位肝組織中性甲醛固定，制備石蠟切片；其氮凍存。

肝細(xì)胞核因子 4α治療大鼠實(shí)驗(yàn)雄性 SD 大鼠隨機(jī)分為 4 組，每組 8 只，第 1 組為正常對照組；2 0.2 g/kg 劑量腹腔注射。每周注射 3 次，隔天注射，連續(xù)注射 1A 誘導(dǎo)的大鼠肝硬化模型。其中第 2 組設(shè)為 Model 組，，第 3 組為，第 4 組為 AdHNF4α 治療組。末次 TAA 注射后 1 周，分別經(jīng)尾09pfu/只 AdGFP 或 5×109pfu/只 AdHNF4α，每周兩次，共三周（圖w 處死大鼠，取相同部位肝組織中性甲醛固定，制備石蠟切片；其凍存。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Bone marrow-derived mesenchymal stem cells protect against experimental liver fibrosis in rats[J];World Journal of Gastroenterology;2005年22期

本文編號(hào)：2630280