【摘要】：急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)是病毒性肝炎一種危重的臨床綜合征,傳統(tǒng)支持治療病死率高達(dá)80%。肝移植是有效的ALF治療措施,但由于肝供體嚴(yán)重缺乏,許多患者在等待供體過程中死亡。生物人工肝支持系統(tǒng)(bioartificial liver support system, BALSS)是未來最有希望在體外提供全面肝功能支持,使患者順利過渡到肝移植或肝再生的有效治療方法。BALSS的關(guān)鍵生物材料是肝細(xì)胞。雖然新鮮分離的豬肝細(xì)胞和人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞都曾經(jīng)被用作BALSS的細(xì)胞材料,但由于存在過敏反應(yīng)、病毒感染和誘發(fā)腫瘤等不安全因素,臨床應(yīng)用受到很大限制。我們應(yīng)用SV40 Tag和端粒酶轉(zhuǎn)染原代人肝細(xì)胞建立了永生化人肝細(xì)胞系(immortalized human hepatocytes, IHH)。前期研究表明,IHH表現(xiàn)高增殖活性,可在微載體上高密度培養(yǎng),體內(nèi)不具有成瘤性。體外分析表明：IHH具有正常肝細(xì)胞的主要功能,表達(dá)與肝臟代謝、解毒、合成相關(guān)的基因和蛋白。將IHH與肝衰竭血清孵育后,可使血清膽紅素進(jìn)行性地降低,尿素進(jìn)行性升高,表明IHH具有對膽紅素和血氨的解毒功能。 目的： 應(yīng)用微載體大規(guī)模培養(yǎng)IHH,構(gòu)建人源性生物人工肝(human-derived bioartificial liver, hBAL),通過對大量ALF血漿灌流解毒的體外實(shí)驗(yàn)和對小鼠ALF模型、恒河猴ALF模型治療的體內(nèi)實(shí)驗(yàn),評價(jià)hBAL治療ALF的有效性和安全性,為hBAL進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)提供依據(jù)。 方法： 應(yīng)用微載體攪拌懸浮方法大規(guī)模高密度培養(yǎng)IHH。 采用腹腔注射四氯化碳(CCl4)建立裸鼠ALF模型,將微載體培養(yǎng)IHH注射于裸鼠腹腔內(nèi)進(jìn)行腹膜透析治療,并設(shè)未治療組和空微載體治療組,比較各組動(dòng)物的肝功能損傷指標(biāo),肝組織病理和動(dòng)物生存率。 將微載體培養(yǎng)IHH和樹脂顆粒灌裝特制容器構(gòu)建IHH細(xì)胞反應(yīng)器,連接蠕動(dòng)泵,對400 mL ALF血漿灌流解毒6 h,IHH細(xì)胞反應(yīng)器再生18 h后,再次進(jìn)行6 h灌流解毒,解毒-再生循環(huán)6次,觀察ALF血漿膽紅素、尿素濃度變化,評價(jià)IHH細(xì)胞反應(yīng)器的體外解毒功能。 用間隔48 h兩次注射D-氨基半乳糖(D-galactosamine, D-GalN)的方法建立恒河猴ALF模型,IHH細(xì)胞反應(yīng)器連接血液凈化裝置制備hBAL,采用連續(xù)10 h每5h更換新的IHH細(xì)胞反應(yīng)器的連續(xù)治療模式及治療5 h,間隔19 h,重復(fù)3次的間隔治療模式對兩只ALF恒河猴分別進(jìn)行了hBAL治療,觀察轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素、血氨、尿素、膽汁酸、血糖、凝血酶原時(shí)間、凝血酶原活動(dòng)度、纖維蛋白原等肝功能損傷指標(biāo)的變化及ALF恒河猴生存情況和不良反應(yīng),評價(jià)hBAL對ALF的療效和安全性。死亡恒河猴肝組織切片HE染色觀察肝壞死情況。對IHH進(jìn)行了染色體分析及SCID鼠成瘤實(shí)驗(yàn)以評價(jià)其安全性。 結(jié)果： 采用微載體技術(shù)可大規(guī)模培養(yǎng)IHH,培養(yǎng)體積可達(dá)500-600mL。 腹腔注射CCl4后24 h,所有小鼠的轉(zhuǎn)氨酶升高達(dá)正常值10倍以上。未治療組和空微載體治療組動(dòng)物48 h內(nèi)全部死亡,肝組織檢查發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞廣泛壞死；而采用IHH-微載體治療組48 h動(dòng)物生存率為83.3%,持續(xù)14d后轉(zhuǎn)為長期存活。存活的動(dòng)物轉(zhuǎn)氨酶降至正常水平,肝組織檢查顯示肝細(xì)胞壞死顯著減少,免疫組織化學(xué)染色顯示腹腔微載體上肝細(xì)胞仍存活,并表達(dá)人肝細(xì)胞特異蛋白α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)。 IHH細(xì)胞反應(yīng)器對ALF血漿灌流解毒6h后,可使血漿總膽紅素下降18%,解毒-再生循環(huán)6次后,可使血漿總膽紅素下降41%；血漿尿素從解毒-再生循環(huán)第4次起升高,到第6次,總升高幅度為22%,而空微載體對照組ALF血漿相應(yīng)指標(biāo)無顯著變化。 間隔48 h兩次注射D-GalN可成功制備恒河猴ALF模型,恒河猴血清轉(zhuǎn)氨酶升高44倍,膽紅素升高5.4倍,血氨升高2.5倍,凝血酶原時(shí)間75秒,凝血酶原活動(dòng)度10%,未經(jīng)治療的恒河猴反應(yīng)遲鈍,進(jìn)食飲水減少,嘔吐,尿少,最長生存時(shí)間不超過63 h。 造模后48 h開始連續(xù)10h的hBAL治療可使恒河猴血液肝損傷指標(biāo)改善：轉(zhuǎn)氨酶下降70-80%；膽紅素下降約70%；血氨未繼續(xù)升高,而尿素水平增高；總膽汁酸(total bile acid, TBA)下降約75%。治療終止后上述指標(biāo)反彈,到造模后4天為反彈高峰。凝血功能未改善,恒河猴生存7.6天。肝組織病理學(xué)檢查顯示與未治療ALF恒河猴比,肝壞死減輕,肝淤血減少。 造模后24 h開始間隔hBAL治療3次,每次均使轉(zhuǎn)氨酶下降約50%,治療終止后,轉(zhuǎn)氨酶反彈升高,但造模后4天的反彈高峰幅度較低,僅為連續(xù)治療的39%；間隔hBAL治療抑制了膽紅素升高,造模后4天的反彈幅度為連續(xù)治療的12%；間隔hBAL治療后尿素水平顯著升高,約為連續(xù)治療的一倍,同時(shí)血氨無顯著升高。間隔hBAL治療還抑制了TBA的升高,改善了凝血功能,造模后7天,凝血功能恢復(fù)正常。經(jīng)3次間隔hBAL治療后,ALF恒河猴痊愈而長期存活。 hBAL治療過程中設(shè)備運(yùn)行穩(wěn)定,各項(xiàng)參數(shù)正常。不良反應(yīng)有低血壓和低血鈣,對癥治療后緩解。 染色體分析示IHH為二倍體,IHH移植SCID鼠皮下和肝臟內(nèi)6個(gè)月未成瘤。 結(jié)論： 應(yīng)用微載體培養(yǎng)IHH可成功制備可再生性人源性生物人工肝。體外實(shí)驗(yàn)中可使400mL ALF血漿膽紅素降低,血漿尿素增高,具有解毒功能。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中可使ALF小鼠和ALF恒河猴生存期延長,肝損傷指標(biāo)改善,療效顯著,安全性好。對ALF恒河猴治療的間隔治療模式療效優(yōu)于連續(xù)治療模式,在肝損傷較輕時(shí)及時(shí)給予BAL治療療效較好。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R575.3

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本文編號(hào)：2630055