【摘要】：腸纖維化是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)發(fā)病過程中一種常見的嚴(yán)重并發(fā)癥,最終可導(dǎo)致腸腔狹窄甚至腸梗阻發(fā)生。由于其發(fā)病機(jī)制尚未明確,迄今尚無理想治療方案。因此,深入研究IBD相關(guān)腸纖維化的發(fā)病機(jī)制可能為臨床治療腸纖維化提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 腸纖維化的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜動態(tài)的過程,主要由于免疫反應(yīng)失衡,腸道細(xì)胞因子如：轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β,TGF-β)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors, IGFs)和血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)等表達(dá)發(fā)生改變,進(jìn)而促進(jìn)以膠原為主的細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix, ECM)過度沉積所致。腸成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是腸纖維化發(fā)生的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。已有研究證實(shí),腸成纖維細(xì)胞(intestinal fibroblasts, IFBs)、效應(yīng)細(xì)胞在上述細(xì)胞因子作用下活化,自身發(fā)生向腸肌成纖維細(xì)胞(intestinal myofibroblasts, IMFs)轉(zhuǎn)化,其增殖、遷移以及合成與分泌ECM的功能增強(qiáng),ECM在腸壁大量沉積,最終導(dǎo)致腸纖維化和狹窄形成。 由于慢性炎癥的持續(xù)存在,腸道間質(zhì)細(xì)胞分泌的膠原代謝酶調(diào)節(jié)平衡發(fā)生紊亂,主要包括基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs),這些酶作用失衡導(dǎo)致ECM合成明顯多于降解,最終導(dǎo)致腸纖維化形成。有研究表明,在IBD發(fā)病過程中,MMPs和TIMPs調(diào)節(jié)膠原代謝的功能失衡。同時(shí),各種細(xì)胞因子改變間質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)行為離不開細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。TGF-β1/Smad3信號通路在纖維化過程中是一條最主要的信號傳導(dǎo)通路。有研究證實(shí),腸纖維化發(fā)生過程中TGF-β1/Smad3表達(dá)與功能明顯上調(diào),由其調(diào)節(jié)的間質(zhì)細(xì)胞活化亦增強(qiáng)。因此,探討促纖維化因子及其信號通路在腸纖維化中的作用對研究其發(fā)病機(jī)制具有重要意義。 腫瘤壞死因子樣配體lA(tumor necrosis factor-like ligand1aberrance, TL1A)是腫瘤壞死因子超家族成員15(TNF superfamily member15, TNFSF15)基因的蛋白產(chǎn)物,可通過與其受體--死亡受體3(death receptor3,DR3)結(jié)合,為T淋巴細(xì)胞的分化提供協(xié)同刺激信號,影響機(jī)體免疫調(diào)節(jié)。近來對TL1A的研究表明,TL1A與IBD密切相關(guān),TNFSF15基因誘導(dǎo)TL1A的表達(dá)促進(jìn)了IBD的發(fā)生與進(jìn)展,INFSF15基因作為IBD的易感基因已得到證實(shí)。 Dr.Targan及其課題組成員研究證實(shí),TL1A及其受體可通過影響腸黏膜T細(xì)胞的活化、增殖,誘導(dǎo)Th細(xì)胞極化,從而導(dǎo)致腸黏膜免疫系統(tǒng)耐受調(diào)節(jié)紊亂,由此引發(fā)腸道炎癥反應(yīng),從而參與IBD的發(fā)生。新近的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TL1A過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)腸炎模型出現(xiàn)腸炎并發(fā)腸纖維化改變。這些都證實(shí)了TL1A在IBD腸黏膜T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,其表達(dá)促進(jìn)了腸黏膜的炎癥和纖維化發(fā)生。盡管TL1A在腸道炎癥中的研究已取得進(jìn)展,但其在腸道纖維化發(fā)生中的作用機(jī)制仍不明確,且干預(yù)TL1A能否成為逆轉(zhuǎn)腸纖維化的新靶點(diǎn)尚需進(jìn)一步探究。為此,本實(shí)驗(yàn)利用野生型(wild type, WT)C57BL/6小鼠及轉(zhuǎn)基因(LCK-CD2-TL1A-GFP-transgenic, L-Tg)兩種遺傳背景的小鼠建立實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎并發(fā)腸纖維化模型,研究TL1A在誘導(dǎo)小鼠腸纖維化中的作用,并探討腸纖維化過程中腸成纖維細(xì)胞以及膠原代謝的改變,旨在揭示TL1A在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化發(fā)生中的機(jī)制,為探索防治腸纖維化的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下三部分： 第一部分TL1A在TNBS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎炎癥中的作用 目的：建立TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠模型,探討TL1A在TNBS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎腸黏膜炎癥中的作用。 方法：①采用real-time Q-PCR方法進(jìn)行LCK-CD2-TL1A-GFP基因型小鼠的鑒定與篩選；②通過三硝基苯磺酸(Trinitro-benzene-sulfonic acid, TNBS)乙醇溶液灌腸建立實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型,L-Tg小鼠與C57BL/6WT小鼠(6-8周)隨機(jī)分為Control/WT組、EtOH/WT組、TNBS+EtOH/WT組、Control/Tg組、EtOH/Tg組、TNBS+EtOH/Tg組,每組6只；TNBS+EtOH組小鼠禁食24h,乙醚麻醉后將聚乙烯導(dǎo)管插入肛門約1cm注入50μLTNBS乙醇溶液,繼續(xù)深入至脾區(qū)(約3cm～4cm)再注入100μL灌腸液,每周重復(fù)灌腸1次,于第1-2周給予2.0mg TNBS,第3-4周給予3.0mgTNBS,最后一次灌腸后第三天處死,EtOH組和Control組分別使用等體積的50%乙醇和蒸餾水溶液灌腸作為對照；③小鼠結(jié)腸炎及腸黏膜炎癥評估包括每天體重(Body weight, BW)改變、疾病活動指數(shù)(Disease activity index, DAI)、結(jié)腸形態(tài)學(xué)改變和病理評分以及髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)檢測；④ELISA法測定血清TNF-α、干擾素-y(Interferon-y, IFN-y)和白細(xì)胞介素17A(Interleukin, IL-17A)的水平；⑤Western blot和real-time Q-PCR技術(shù)測定腸道組織中TNF-α、IFN-γ、IL-17A的蛋白和mRNA水平。 結(jié)果：①根據(jù)基因LCK-CD2-TL1A-GFP序列測定小鼠DNA,目的基因在Tg小鼠成像在192bp位置,而WT小鼠基因測定成像,在192bp位置未檢測到目的基因,據(jù)此可以篩選鑒定Tg小鼠；②在兩種小鼠中,與Control組和EtOH組相比,TNBS+EtOH組小鼠經(jīng)TNBS乙醇溶液灌腸后,出現(xiàn)厭食、精神狀態(tài)萎靡、體重下降、DAI評分與病理評分增加,結(jié)腸質(zhì)地變硬,長度縮短,腸壁出現(xiàn)水腫、充血,結(jié)腸組織病理切片顯示腸道結(jié)構(gòu)破壞,黏膜及黏膜下層出現(xiàn)中性粒細(xì)胞浸潤；兩種小鼠的Control組和EtOH組腸道改變均無明顯差異,TNBS+EtOH/Tg組較TNBS+EtOH/WT組腸道炎癥反應(yīng)增強(qiáng)；㈢MPO結(jié)果顯示：在WT和Tg小鼠組,與Control組和EtOH組相比,TNBS+EtOH組小鼠結(jié)腸MPO活性明顯升高,而兩種小鼠的Control組和EtOH組間MPO均無明顯差異,TNBS+EtOH/Tg組結(jié)腸MPO活性較TNBS+EtOH/WT組顯著升高；④ELISA結(jié)果顯示：在WY和Tg小鼠組,TNBS+EtOH組小鼠血清TNF-α IFN-γ、IL-17A水平較Control組和EtOH組明顯升高,兩種小鼠的Control組和EtOH組血清細(xì)胞因子無明顯差異,同時(shí)TNBS+EtOH/Tg組較TNBS+EtOH/WT組升高更為明顯；⑤應(yīng)用Western blot和real-time Q-PCR技術(shù)檢測小鼠腸組織中TNF-α、IFN-γ和IL-17A的表達(dá),結(jié)果顯示,TNBS+EtOH/WT組較Control/WT組小鼠腸組織炎癥因子表達(dá)升高,TNBS+EtOH/Tg組較Control/Tg組小鼠腸組織炎癥因子表達(dá)升高,同時(shí)TNBS+EtOH/Tg組較TNBS+EtOH/WT組升高更明顯,在兩種小鼠的Control組和EtOH組腸道中表達(dá)無明顯差異。 結(jié)論：通過TNBS灌腸方法成功建立了實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型,TL1A能促進(jìn)TNF-α、IFN-γ和IL-17A產(chǎn)生,上調(diào)Th1和Th17介導(dǎo)的免疫反應(yīng),從而增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸道黏膜炎癥的發(fā)生。 第二部分TL1A在TNBS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化發(fā)生中的作用與機(jī)制研究 目的：深入探討TL1A在TNBS誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化發(fā)生中的作用及機(jī)制。 方法：①造模方法與實(shí)驗(yàn)分組同第一部分；②Masson's trichrome staining(MT染色)、天狼猩紅染色檢測膠原沉積評估腸纖維化程度改變；③采用免疫組織化學(xué)法檢測Ⅰ型膠原、Ⅲ膠原、TIMP-1、波形蛋白(Vimentin)、α平滑肌蛋白(a-smooth muscle actin, α-SMA)以及TGF-β1/Smad3在小鼠結(jié)腸組織中的的表達(dá)；④Western blot和real-timeQ-PCR技術(shù)測定腸組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TIMP-1、Vimentin、α-SMA、 TGF-β1/Smad3蛋白和mRNA水平。 結(jié)果：①M(fèi)T染色和天狼猩紅染色顯示,在TNBS誘導(dǎo)的WT和Tg小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型中,與Control組小鼠相比,TNBS+EtOH組小鼠結(jié)腸黏膜下層和漿膜層出現(xiàn)大量膠原沉積,而兩類小鼠的Control組和EtOH組均無明顯差異,TNBS+EtOH/Tg組較TNBS+EtOH/WT組改變更為明顯；②采用免疫組織化學(xué)染色顯示,在WT和Tg小鼠組,TNBS+EtOH組成纖維細(xì)胞的增殖與活化較Control組和EtOH組增強(qiáng),Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Vimentin及a-SMA合成與分泌增加；TGF-β1/Smad3在Control組僅少量表達(dá),TIMP-1表達(dá)甚微或無表達(dá),EtOH組與Control組比較,上述指標(biāo)表達(dá)量有所增加,但無統(tǒng)計(jì)差異,這可能與乙醇溶劑輕微損傷腸道黏膜導(dǎo)致的組織修復(fù)有關(guān),且Tg與WT小鼠之間也無明顯差別,而在TNBS+EtOH組纖維化發(fā)生過程中TGF-β1、Smad3、TIMP-1陽性表達(dá)增加,陽性表達(dá)部位可在腸道組織各層且細(xì)胞胞漿與細(xì)胞胞膜均有表達(dá),TNBS+EtOH/Tg組較TNBS+EtOH/WT組更為明顯；③Western blot(?)(?)real-time Q-PCR測定腸道組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TIMP-1、Vimentin、 α-SMA、TGF-β1、Smad3、表達(dá),結(jié)果顯示：在WT和Tg小鼠組,TNBS+EtOH組較Control組腸組織中表達(dá)明顯升高,Control組與EtOH組相比蛋白和mRNA表達(dá)無差異；TNBS+EtOH/Tg組較TNBS+EtOH/WT組表達(dá)更為明顯。 結(jié)論：TL1A過表達(dá)可促進(jìn)TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸成纖維細(xì)胞活化、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原合成增強(qiáng)以及TIMP-1表達(dá)上調(diào)；TGF-β1/Smad3信號通路介導(dǎo)的腸成纖維細(xì)胞活化,可能是腸道炎癥并發(fā)腸纖維化的機(jī)制之一。 第三部分抗TL1A抗體對小鼠T細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化的影響 目的：探討抗TL1A抗體對T細(xì)胞移植結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥及纖維化改變的調(diào)節(jié)作用。 方法：①運(yùn)用T細(xì)胞分選技術(shù)分別提取來自建立野生型(wild type, WT)C57BL/6小鼠(?)(?)LCK-CD2-TL1A-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的CD4+CD45RBhigh原始T細(xì)胞,向Rag-/-小鼠腹腔內(nèi)注入,建立T細(xì)胞轉(zhuǎn)移結(jié)腸炎模型,預(yù)防性干預(yù)是在注射CD4+CD45RBhighT細(xì)胞后第一天開始給予抗TL1A抗體,每周兩次,持續(xù)6周,抗體劑量為500μg；治療性干預(yù)則是在注射CD4+CD45RBhigh細(xì)胞四周后即第29天或體重下降超過10%時(shí)給予抗TL1A抗體干預(yù),每周兩次,持續(xù)4周,抗體劑量為500μg；預(yù)防性干預(yù)與治療性干預(yù)同期給予同種型免疫球蛋白G(Isotype)作為對照組。實(shí)驗(yàn)分組如下：(1) WT-Prevention Isotype組：使用來自WT小鼠的CD4+CD45RBhighT細(xì)胞注射Rag-/-小鼠建立T細(xì)胞轉(zhuǎn)移結(jié)腸炎模型,預(yù)防性給予同種型免疫球蛋白G作為對照(Isotype);(2)WT-Prevention Ab組：使用來自WT小鼠的CD4+CD45RBhighT細(xì)胞注射Rag-/-小鼠建立T細(xì)胞轉(zhuǎn)移結(jié)腸炎模型,預(yù)防性給予抗TL1A抗體干預(yù)(Ab)；(3)Tg-Prevention Isotype組：使用來自Tg小鼠的CD4+CD45RBhighT細(xì)胞注射Rag-/-小鼠建立T細(xì)胞轉(zhuǎn)移結(jié)腸炎模型,預(yù)防性給予同種型免疫球蛋白G作為對照(Isotype);(4)Tg-Prevention Ab組：使用來自Tg小鼠的CD4+CD45RBhighT細(xì)胞注射Rag-/-小鼠建立T細(xì)胞轉(zhuǎn)移結(jié)腸炎模型,預(yù)防性給予抗TL1A抗體干預(yù)(Ab);(5)WT-Treatment Isotype組：使用來自WT小鼠的CD4+CD45RBhighT細(xì)胞注射Rag-/-小鼠建立T細(xì)胞轉(zhuǎn)移結(jié)腸炎模型,治療性給予同種型免疫球蛋白G作為對照(Isotype);(6)WT-Treatment Ab組：使用來自WT小鼠的CD4+CD45RBhighT細(xì)胞注射Rag-/-小鼠建立T細(xì)胞轉(zhuǎn)移結(jié)腸炎模型,治療性給予抗TL1A抗體干預(yù)(Ab)；(7)Tg-Treatment Isotype組：使用來自Tg小鼠的CD4+CD45RBhighT細(xì)胞注射Rag-/-小鼠建立T細(xì)胞轉(zhuǎn)移結(jié)腸炎模型,治療性給予同種型免疫球蛋白G作為對照抗體(Isotype);(8) Tg-Treatment Ab組：使用來自Tg小鼠的CD4+CD45RBhighT細(xì)胞注射Rag-/小鼠建立T細(xì)胞轉(zhuǎn)移結(jié)腸炎模型,治療性給予抗TL1A抗體干預(yù)(Ab)；②結(jié)腸組織切片經(jīng)Haematoxylineosin staining(HE染色)觀察腸黏膜炎癥,Masson's trichrome staining(MT染色)及天狼猩紅染色觀察腸纖維化程度并行病理評分；③免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)腸組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TIMP-1、Vimentin、α-SMA和TGF-β1/Smad3蛋白表達(dá)。 結(jié)果：①采用HE染色、MT染色及天狼猩紅染色結(jié)果證明T細(xì)胞移植方法建立了實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎相關(guān)腸道纖維化模型。Tg-Prevention Isotype組與WT-Prevention Isotype相比較,Tg-Treatment Isotype組與WT-Treatment Iostype組相比較,Tg小鼠腸道腺體結(jié)構(gòu)破壞明顯,黏膜下層出現(xiàn)明顯炎癥細(xì)胞侵潤,膠原沉積明顯增加,炎癥及纖維化病理評分升高；使用抗TL1A抗體進(jìn)行預(yù)防性和治療性干預(yù)發(fā)現(xiàn),WT-Prevention Ab組與WT-Prevention Isotype組比較、Tg-Prevention Ab組與Tg-Prevention Isotype組比較、WT-Treatment Ab組與WT-Treatment Isotype組比較,Tg-Treatment Ab組與Tg-Treatment Isotype組比較、WT-Prevention Ab組與WT-Treatment Ab組比較、Tg-Prevention Ab組與Tg-Treatment Ab組比較,抗TL1A抗體干預(yù)后腸黏膜損傷與膠原沉積減輕,病理評分降低,預(yù)防性干預(yù)較治療性干預(yù)降低病理評分效果更明顯；WT-Prevention Isotype組與WT-Treatment Isotype組比較、Tg-Prevention Isotype組與Tg-Treatment Isotype組比較,腸道炎癥與纖維化改變無差異。②免疫組織化學(xué)檢測腸組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ膠原和TIMP-1結(jié)果顯示：Tg-Prevention Isotype組與WT-Prevention Isotype組相比較,Tg-Treatment Isotype組與WT-Treatment Iostype組相比較,Tg小鼠結(jié)腸組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ膠原和TIMP-1陽性面積比值升高；WT-Prevention Ab組與WT-Prevention Isotype組比較、Tg-Prevention Ab組與Tg-Prevention Isotype組比較、WT-Treatment Ab組與WT-Treatment Isotype組比較,Tg-Treatment Ab組與Tg-Treatment Isotype組比較、WT-Prevention Ab組與WT-Treatment Ab組比較、Tg-Prevention Ab組與Tg-Treatment Ab組比較,抗TL1A抗體干預(yù)之后Ⅰ型膠原、Ⅲ膠原、TIMP-1陽性面積比值降低；WT-Prevention Isotype組與WT-Treatment Isotype組比較、Tg-Prevention Isotype組與Tg-Treatment Isotype組比較,陽性面積比值無明顯差異。③免疫組織化學(xué)檢測腸組織中Vimentin和a-SMA表達(dá),結(jié)果顯示：Tg-Prevention Isotype組與WT-Prevention Isotype組相比較,Tg-Treatment Isotype組與WT-TreatmentIostype組相比較,Tg小鼠結(jié)腸組織中Vimentin及a-SMA陽性面積比值升高；WT-Prevention Ab組與WT-Prevention Isotype組比較、Tg-PreventionAb組與Tg-Prevention Isotype組比較、WT-Treatment Ab組與WT-Treatment Isotype組比較,Tg-Treatment Ab組與Tg-Treatment Isotype組比較、WT-Prevention Ab組與WT-Treatment Ab組比較、Tg-Prevention Ab組與Tg-Treatment Ab組比較,抗TL1A抗體干預(yù)之后Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Vimentin及α-SMA陽性面積比值降低,預(yù)防效果更明顯；WT-Prevention Isotype組與WT-Treatment Isotype組比較、Tg-Prevention Isotype組與Tg-Treatment Isotype組比較,陽性面積比值無明顯差異；④免疫組織化學(xué)檢測腸組織中TGF-β1\Smad3結(jié)果顯示：Tg-Prevention Isotype組與WT-Prevention Isotype組相比較,Tg-Treatment Isotype組與WT-Treatment Iostype組相比較,Tg小鼠結(jié)腸組織中TGF-β1\Smad3陽性面積比值升高；WT-Prevention Ab組與WT-Prevention Isotype組比較、Tg-Prevention Ab組與Tg-Prevention Isotype組比較、WT-Treatment Ab組與WT-Treatment Isotype組比較,Tg-Treatment Ab組與Tg-Treatment Isotype組比較、WT-Prevention Ab組與WT-Treatment Ab組比較、Tg-Prevention Ab組與Tg-Treatment Ab組比較,抗TL1A抗體干預(yù)之后TGF-β1\Smad3陽性面積比值降低；WT-Prevention Isotype組與WT-Treatment Isotype組比較、Tg-Prevention Isotype組與Tg-Treatment Isotype組比較,陽性面積比值無明顯差異。 結(jié)論：抗TL1A抗體可減輕TL1A介導(dǎo)的結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化,預(yù)防性干預(yù)效果優(yōu)于治療性干預(yù),其機(jī)制可能與抑制腸成纖維細(xì)胞活化、下調(diào)TGF-β1/Smad3信號通路有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R574

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2630019