【摘要】： 隨著全腸外營(yíng)養(yǎng)支持(TPN)和家庭腸外營(yíng)養(yǎng)支持(HPN)治療的進(jìn)步,不少因短腸綜合征而導(dǎo)致腸功能衰竭的患者已經(jīng)能夠獲得較為滿意的生活質(zhì)量。但是終究無(wú)法擺脫嚴(yán)重的、甚至致命的并發(fā)癥的威脅,如導(dǎo)管感染、嚴(yán)重的膽汁淤積和慢性繼發(fā)性肝病等。當(dāng)腸衰竭患者合并有不可逆性肝損傷時(shí)就需要進(jìn)行肝-腸聯(lián)合移植。盡管小腸移植的生存率在逐年提高,隨著新的免疫抑制劑的應(yīng)用,小腸移植的病人一年生存率已與肝臟移植病人接近。但供體的缺乏等因素,仍然是目前很難解決的問(wèn)題。使腸蠕動(dòng)速度減慢的手術(shù)方式不符合生理,效果不滿意,能獲益者甚少,甚至是有害無(wú)益。 位于隱窩底部潘氏細(xì)胞之上的未分化細(xì)胞,是能夠分化出小腸粘膜成熟上皮細(xì)胞的多能干細(xì)胞。正是小腸粘膜干細(xì)胞的各種特性維持著小腸粘膜的完整性及小腸粘膜細(xì)胞的不斷周期性更新。小腸粘膜干細(xì)胞的研究已經(jīng)有三十多年的歷史。目前多數(shù)研究認(rèn)為小腸粘膜類器官片段來(lái)源的小腸邊緣群(side-population,SP)細(xì)胞是能夠干細(xì)胞的細(xì)胞群體,本研究目的在于分析大鼠小腸粘膜SP細(xì)胞的生物學(xué)特性,并進(jìn)一步探索其在短腸綜合征大鼠的移植治療作用。 第一部分:大鼠胎鼠小腸粘膜邊緣群細(xì)胞生物學(xué)特性研究 目的:分離邊緣群(side population,SP)細(xì)胞是富集干細(xì)胞的有效技術(shù)手段,近期實(shí)驗(yàn)證實(shí)小鼠來(lái)源的小腸粘膜SP細(xì)胞富集小腸粘膜干細(xì)胞。本研究目的在于分析大鼠來(lái)源的SP細(xì)胞生物學(xué)特性,為小腸粘膜SP細(xì)胞在大鼠模型中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:取Wistar大鼠胎鼠小腸全長(zhǎng),按文獻(xiàn)方法制作小腸粘膜的類器官片段并制備成單細(xì)胞懸液。使用Hoechst33342和PI (Propidium iodide)染色后用流式細(xì)胞儀分選SP細(xì)胞。提取分選前后的細(xì)胞總RNA和蛋白,用實(shí)時(shí)定量PCR及Western-blot方法分別檢測(cè)其中Musashi-1mRNA及Musashi-1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:流式細(xì)胞分選儀圖形顯示大鼠胎鼠來(lái)源的小腸粘膜單細(xì)胞懸液的細(xì)胞群圖形呈“鳥嘴樣”,且染色液中加入維拉帕米后“鳥嘴”部分即SP細(xì)胞群消失。定量PCR及Western-blot檢測(cè)顯示SP細(xì)胞中Musashi-1mRNA含量是分選前細(xì)胞的8.125倍,是非SP細(xì)胞的20.077倍。Western-blot結(jié)果顯示Musashi-1蛋白水平明顯高于分選前。 結(jié)論:大鼠胎鼠的SP細(xì)胞富集小腸粘膜干細(xì)胞,與小鼠來(lái)源的SP細(xì)胞生物學(xué)特性基本一致。 第二部分:移植小腸粘膜邊緣群細(xì)胞治療大鼠短腸綜合征的實(shí)驗(yàn)研究 目的:觀察移植小腸粘膜SP細(xì)胞對(duì)短腸綜合征大鼠的治療作用。方法:Wistar大鼠切除75%小腸后隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組(n=9)和對(duì)照組(n=11)。手術(shù)后第五天所有大鼠給予全身照射(300cGy),照射后24小時(shí)內(nèi)實(shí)驗(yàn)組在顯微鏡下將5×105小腸粘膜SP細(xì)胞注射到大鼠小腸粘膜下,對(duì)照組注射同樣體積的1×HBSS。每日稱量大鼠體重,移植四個(gè)月后檢測(cè)木糖吸收實(shí)驗(yàn)、氮平衡實(shí)驗(yàn)、脂肪平衡實(shí)驗(yàn),處死大鼠后測(cè)定小腸長(zhǎng)度、濕重、面積,并行組織學(xué)檢測(cè),統(tǒng)計(jì)絨毛高度、隱窩深度及絨毛密度。 結(jié)果:移植四個(gè)月后,實(shí)驗(yàn)組大鼠體重及移植后增長(zhǎng)體重(280±23g,122±25g)明顯均高于對(duì)照組(252±21g,98±23g)(P0.05)。實(shí)驗(yàn)組小腸長(zhǎng)度(39.0±9.8cm)明顯高于對(duì)照組(26.5±6.7cm)(P0.01);實(shí)驗(yàn)組的木糖吸收率(0.17±0.07%)明顯高于對(duì)照組(0.10±0.04%)(P0.05);實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組脂肪吸收率分別為0.98±0.01%和0.86±0.08%,實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組(P0.05)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組氮總利用率分別為0.53%±0.14%和0.38%±0.17%,實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組(P0.05)。 結(jié)論:移植小腸粘膜SP細(xì)胞能夠增加小腸的吸收面積和吸收能力。 第三部分:穩(wěn)定性同位素示蹤法檢測(cè)移植小腸粘膜SP細(xì)胞后小腸吸收能力的變化 目的:本研究目的在于檢測(cè)移植小腸粘膜SP細(xì)胞后的大鼠對(duì)同位素標(biāo)記的氨基酸吸收能力的變化,研究移植后大鼠小腸吸收能力的變化。 方法:實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和正常組大鼠,用15N標(biāo)記的亮氨酸(0.25g/kg)灌胃,在灌胃后15分鐘、0.5h、1h、2h抽血,測(cè)定各血清標(biāo)本中的15N—Leucine豐度。根據(jù)不同時(shí)間15N—Leucine在血清中的豐值繪制吸收曲線。通過(guò)15N—Leucine在血中豐度的峰值和豐度時(shí)相曲線下面積判斷15N—Leucine的吸收情況。 結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均在半小時(shí)達(dá)到吸收高峰,實(shí)驗(yàn)組吸收曲線下面積為正常組的70%,對(duì)照線吸收曲線下面積為正常組37%。實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組(P0.01)。 結(jié)論:小腸粘膜SP細(xì)胞移植能增強(qiáng)短腸大鼠對(duì)氨基酸吸收能力。 第四部分:地高辛標(biāo)記的原位雜交法檢測(cè)供體細(xì)胞在受體小腸內(nèi)分布 目的:應(yīng)用地高辛標(biāo)記的原位雜交方法,檢測(cè)雄性大鼠的小腸粘膜SP細(xì)胞在受體小腸內(nèi)的分布增殖情況。 方法:大鼠麻醉后處死,取小腸制備12μm切片,進(jìn)行原位雜交檢測(cè)。結(jié)果:在移植組的大鼠小腸標(biāo)本中,顯著增生部位的隱窩及絨毛部位均能檢測(cè)到細(xì)胞核中Y染色體存在的標(biāo)志供者來(lái)源細(xì)胞。 結(jié)論:結(jié)果證明供體來(lái)源的細(xì)胞能較長(zhǎng)時(shí)間在受體小腸內(nèi)生存并參與小腸粘膜的修復(fù)與再生,結(jié)合前面的研究結(jié)果,表明小腸粘膜SP細(xì)胞移植對(duì)短腸綜合征大鼠治療有重要意義。
【圖文】：

圖 1 流式細(xì)胞儀分選圖。A）分選細(xì)胞在含有 5mg/mlHoechst33342 的 1×HBSS 中孵育。B) 孵育液中加用 100 μmol/L 維拉帕米2. 小腸粘膜 SP 細(xì)胞的 Musashi-1的表達(dá)1) Musashi-1mRNA 水平實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 結(jié)果顯示 SP 細(xì)胞中的 Musashi-1mRNA 含量是分選前的8.125 倍，是非 SP 細(xì)胞的 20.077 倍(圖 2、3)。

0123456789M SP NFoldValueal time -PCR 分析 Musashi-1mRNA 的相對(duì)含量，M(mix),SP,N 分選后的 SP細(xì)胞和非 SP 細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R574

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 黎介壽;成人短腸綜合征的治療進(jìn)展[J];腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng);2005年05期

2 仇惠英;薛永權(quán);潘金蘭;吳亞芳;陳蘇寧;孫愛寧;吳德沛;;熒光原位雜交法檢測(cè)造血干細(xì)胞移植后骨髓嵌合狀態(tài)和微量殘留病灶[J];中華器官移植雜志;2006年08期

，

本文編號(hào)：2621238