【摘要】： 第一章：雙歧桿菌CMS-H004株加重UC損傷的實驗研究 目的： 在前期研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌CMS-H004株有加重UC損傷作用的基礎(chǔ)上，用多株雙歧桿菌比較的方法，驗證是否CMS-H004株具有加重UC損傷的株特異性。 方法： Balb／c小鼠70只，隨機分為7組：1)正常組；2)模型組；3)陰性對照(NS組)；4)陽性對照(5-ASA組)；5)CMS-H004組；6)PFK組；7)JSQ組。5％DSS溶液自由飲用7天造成小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，通過觀察、檢測小鼠癥狀、體征、疾病活動度評分、病理組織學評分、電鏡結(jié)構(gòu)、結(jié)腸長度、腸道菌群分析、髓過氧化物酶活性、腫瘤壞死因子濃度等指標，評估雙歧桿菌CMS-H004株與培菲康、金雙歧中的雙歧桿菌菌株對DSS誘導的UC的影響。 結(jié)果： 雙歧桿菌CMS-H004株能夠明顯加重DSS誘導的UC模型損傷。其相當于人類UC的臨床表現(xiàn)項目如：體重下降、隱血、血便及死亡時間等出現(xiàn)得最早，便血率、死亡率最高，疾病的DAI積分最高，粘膜損傷的病理學改變也最嚴重，結(jié)腸MPO活性最高，與其它各組比較有顯著性差異(P＜0.05)。PFK、JSQ菌株以上各項損傷指標均沒有DSS組嚴重。飲用DSS后腸道乳酸桿菌數(shù)目減少，擬桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌明顯增加，腸球菌、雙歧桿菌和總需氧菌無明顯變化；CMS-H004組菌群變化與模型組相似，其雙歧桿菌數(shù)目并未增加。 結(jié)論： 1)在結(jié)腸粘膜有損傷的基礎(chǔ)上，雙歧桿菌CMS-H004株能夠加重黏膜損傷； 2) DSS可使腸道乳酸桿菌減少，而不影響雙歧桿菌數(shù)量；應(yīng)用雙歧桿菌CMS-H004株與其相似，但并不增加腸道雙歧桿菌。 第二章：雙歧桿菌CMS-H004株加重UC損傷的機理研究 目的： 從炎癥因子、緊密連接、防御素不同角度體內(nèi)、體外初步探討雙歧桿菌CMS-H004株加重UC損傷的機理。 方法： Balb／c小鼠45只，隨機分為3大組、9小組：N3、N5、N7是正常組第3、5、7天：M3、M5、M7是DSS模型組飲用DSS后第3、5、7天；B3、B5、B7是CMS-H004菌株灌腸組飲用DSS后第3、5、7天。5％DSS溶液自由飲用7天造成小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型。RT-PCR和免疫印跡法檢測不同時間點結(jié)腸組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA和蛋白質(zhì)水平的表達；免疫印跡法檢測不同時間點結(jié)腸緊密連接蛋白ZO-1和β-防御素-2蛋白質(zhì)的表達。 體外培養(yǎng)HT-29細胞，與雙歧桿菌CMS-H004株、PFK株共孵育1小時后用TNF-α刺激3小時，檢測其上清LDH含量和NF-κB轉(zhuǎn)錄入細胞核的數(shù)目。 結(jié)果： 1)飲用DSS誘導損傷后IL-1β、IL-6、TNF-α均開始有表達，但CMS-H004組在飲用DSS第3天后出現(xiàn)表達，而模型組是在飲用DSS第5天后出現(xiàn)，同一時間點CMS-H004組IL-1β、IL-6、TNF-α表達量高于模型組，正常組幾乎不表達以上炎癥因子。 2)正常組小鼠結(jié)腸高表達ZO-1蛋白，飲用DSS 7天后模型組和CMS-H004組ZO-1蛋白表達均低于正常組，模型組和CMS-H004組表達量無顯著性差異。 3)正常組小鼠結(jié)腸幾乎不表達BD-2蛋白，模型組和CMS-H004組在飲用DSS第5天后即有BD-2表達，但CMS-H004組BD-2表達量比模型組少。 4) TNF-α刺激HT-29細胞后各組培養(yǎng)液上清中LDH含量無顯著性差異。 5) TNF-α體外刺激HT-29細胞后，除正常組外均均有NF-κB轉(zhuǎn)錄入核，其中CMS-H004組數(shù)目最多。 結(jié)論： 1)雙歧桿菌CMS-H004株能夠促進炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α提前釋放； 2)雙歧桿菌CMS-H004株能夠促進腸上皮細胞NF-κB轉(zhuǎn)錄入核； 3) DSS和CMS-H004株能破壞腸上皮細胞緊密連接、誘導β-防御素-2表達，可能不是CMS-H004株加重損傷的主要機制。 第三章：CMS-H004菌株的分離、鑒定與相關(guān)研究 目的： 為后續(xù)可能的開發(fā)、臨床研究及專利要求，進一步對CMS-H004專利菌株進行鑒定和相關(guān)研究，并將其保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。 方法： 通過光鏡、電鏡觀察其形態(tài)學特征；通過生化反應(yīng)、X-gal顯色、代謝產(chǎn)物檢測觀察CMS-H004菌株生理、生化特征；通過(G+C)mol％測定、16SrRNA、質(zhì)粒檢測觀察其遺傳學特性；通過體外耐酸耐膽汁、抗生素敏感實驗，研究其相關(guān)特性。 結(jié)果： 1) CMS-H004株是革蘭氏染色陽性桿菌，在MRS瓊脂平皿上呈現(xiàn)圓形，白色，隆起，不透明，邊緣整齊的濕潤菌落。 2) CMS-H004株能利用葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、麥芽糖、水楊素、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、七葉靈、甘油、纖維二糖、海藻糖、松三糖、棉子糖、山梨醇、鼠李糖，API 20A編碼為：47757732。 3) CMS-H004株主要代謝產(chǎn)物是乙酸和乳酸，比值約為2.63：1，還可產(chǎn)生少量琥珀酸。 4) CMS-H004株(G+C)mol％為58.64％，無質(zhì)粒。利用雙歧桿菌特異性引物能夠產(chǎn)生預期的擴增條帶。 5) CMS-H004株體外能夠耐酸、耐膽汁。 6)氯霉素、氧哌嗪青霉素、四環(huán)素、頭孢孟多、先鋒噻唑、米諾環(huán)素、阿奇霉素、利福平對CMS-H004株抑菌圈均大于10mm，慶大霉素抑菌圈為7.5mm左右，其余33種抗生素無明顯抑菌圈。 結(jié)論： 1) CMS-H004株是青春雙歧桿菌的一株，已保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其典藏編號是：CCTCC M 206119。 2) CMS-H004株能夠耐酸、耐膽汁，可以經(jīng)過上消化道定植于腸道。 3) CMS-H004株對氯霉素、氧哌嗪青霉素、四環(huán)素、頭孢孟多、先鋒噻唑、米諾環(huán)素、阿奇霉素、利福平敏感，對慶大霉素中度敏感，，對其余33種抗生素耐藥。 第四章：雙歧桿菌CMS-H004株抗體的制備與檢測 目的： 制備雙歧桿菌CMS-H004株的兔多克隆抗體。 方法： 提取CMS-H004株菌體蛋白，加入佐劑作為抗原常規(guī)免疫新西蘭大白兔。達到一定效價后取血清，飽和硫酸銨沉淀法鹽析、透析脫鹽初步純化兔IgG。用ELISA、免疫印跡和免疫培養(yǎng)的方法檢測該抗體的最佳使用濃度、特異性、敏感性，并用此抗體檢測UC患者與正常人糞便中的CMS-H004菌株。 結(jié)果： 1)雙歧桿菌CMS-H004株能刺激產(chǎn)生兔多克隆抗體，隨著抗體濃度不斷降低，與CMS-H004菌體蛋白反應(yīng)也下降，在0.05μg/ml以下反應(yīng)很弱且變化不大，選用0.5μg／ml為最佳使用濃度。 2)不同細菌與抗體(0.5μg／ml)反應(yīng)，抗體與雙歧桿菌CMS-H004菌體蛋白的反應(yīng)最強，有顯著性差異(P＜0.05)；雙歧桿菌PFK、JSQ反應(yīng)次之，而乳酸桿菌CMS-H001、CMS-H002及NS幾乎無反應(yīng)。 3)部分正常人(4／20)和部分潰瘍性結(jié)腸炎患者(3／12)糞便中可見少量CMS-H004菌落生長，其余潰瘍性結(jié)腸炎(9／12)患者糞便中可見大量菌落生長。 結(jié)論： 1)雙歧桿菌CMS-H004株能刺激新西蘭大白兔產(chǎn)生抗體，抗體濃度、特異性、敏感性較好。 2)小樣本檢測顯示雙歧桿菌CMS-H004株存在于20％正常人和所有UC患者糞便中。
【圖文】：

中南大學博士學位論文第一章實驗結(jié)果1、小鼠體重改變飲用DSS可以造成腹瀉、便血等癥狀，會導致小鼠體重下降，癥狀越嚴重體重下降越多。實驗前及飲用DSS前各組小鼠體重差異無顯著性，正常組小鼠體重逐漸增加，而飲用DSS后，CMS一HO04組體重下降最早(飲用DSS第2天后就出現(xiàn))、最多，與其余各組比較具有顯著性差異(P<0.05)。模型組、NS組、5一ASA組、PFK組、JsQ組小鼠體重在飲用DSS后第4天均開始明顯下降，與正常組比較均有顯著性差異(P<0.05)，其中5一ASA組體重下降相對少。見圖l一l。

腸內(nèi)可見血便，以CMS一HO04組小鼠最為嚴重。而5一ASA組、PFK組、JsQ組結(jié)腸平均長度長于CMS一H004組、模型組和NS組，少量小鼠結(jié)腸內(nèi)可見少量出血，大部分小鼠結(jié)腸內(nèi)未見明顯血便。見圖1一2(A一G)。
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R574.62

【參考文獻】

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本文編號：2620561