【摘要】： 研究背景 腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是臨床常見疾病之一。目前診斷仍然依靠癥狀、排他性診斷，缺乏生化標志物及解剖學異常。內臟高敏感是目前公認的IBS重要病理生理機制之一。近來發(fā)現(xiàn)NMDA受體與內臟高敏感的形成和維持密切相關。NMDA受體是興奮性氨基酸的特異性受體，參與體內各種信號傳遞和調節(jié)神經元的興奮性。其中,含2B亞基的NMDA受體(NR2B)在傷害性感受的傳遞和調制、中樞可塑性形成中發(fā)揮重要作用。 流行病學研究提示IBS的發(fā)病以女性多見。動物實驗研究亦表明皮下注射雌激素增加大鼠的內臟敏感性。雌激素作用包括，通過雌激素受體的基因組效應，和通過膜受體的非基因組效應。雌激素對內臟高敏感影響主要是通過何種效應發(fā)揮作用尚不清楚。 應激是IBS癥狀發(fā)生或加重的一個重要因素，雌激素影響著對應激的反應水平。雌激素是雌性大鼠急性束縛應激引起內臟敏感升高的必要因素。另外研究表明，避水應激，作為一種心理應激，可造成大鼠穩(wěn)定、持續(xù)約30大的內臟高敏感。而雌激素是否影響慢性心理應激內臟高敏感形成，尚未見報道。 為此，本課題以避水應激為模型，研究雌激素對內臟高敏感形成的影響，并通過雌激素受體拮抗劑ICI 182，780、NMDA受體競爭性拮抗劑AP5、NR2B選擇性拮抗劑Ro25-6981進一步闡明雌激素作用機制。 方法與結果 1、雌性大鼠內臟高敏感模型的建立及檢測 目的：我們首先觀察避水應激是否引起正常雌性大鼠內臟高敏感形成，以明確定避水應激作為雌性大鼠內臟高敏感造模方法的可行性。 方法：通過埋置腹壁電極記錄20-40-60-80mmHg梯度壓力結直腸擴張內臟運動反射(VMR)腹外斜肌收縮的肌電圖，計算曲線下面積，以VMR幅度值來評價大鼠的內臟痛敏感性。將16只成年雌性大鼠隨機分成2組，避水應激組(WAS)和假應激組(shamWAS)，分別予分別避水應激和假避水應激。連續(xù)應激10天，每天1小時。應激前，測VMR基礎值；避水應激完成后，繼續(xù)飼養(yǎng)4天，冉次測定后VMR幅度。開胸心室取血、以放射免疫法測定血漿CRF、ACTH的水平，灌注固定后取大腦用于c-fos免疫染色。比較WAS組和shamtWAS組大鼠VMR、血漿CRF和ACTH、杏仁核及室旁核c-Fos免疫陽性細胞(c-FLI)的差異。 結果：WAS引起雌性大鼠內臟高敏感，應激大鼠結腸無病理學改變。大鼠經反復避水應激后，WAS大鼠血漿ACTH濃度(77．19±22．71)pg／ml，明顯低于假應激組shamWAS的(148．71±50．37)pg／ml(P0．01)。WAS大鼠血漿CRF濃度35．41±22．71pg／ml，與假應激組shamWAS的(43．82±14．76)pg／ml無明顯差異。WAS組大鼠室旁核c-FLI數(shù)24.33±4．93，與sham-WAS組22．14±3．82之間沒有顯著性差異(p0．05)。WAS組大鼠杏仁核c-FLI數(shù)25．64±5．39，明顯多于sham-WAS組19．62±3．62(p0．05)。 小結：WAS可作為雌性大鼠內臟高敏感造模方法。WAS后大鼠血漿ACTH水平降低，而CRF無變化。c-FLI數(shù)，在WAS大鼠杏仁核表達增加，而室旁核無變化。2、雌激素與內臟高敏感形成關系的研究 目的：P2X_3受體在介導痛覺中發(fā)揮重要作用。本部分實驗觀察雌激素是否影響避水應激大鼠內臟高敏感的形成，以及P2X_3受體蛋白表達變化。 方法：將卵巢切除后雌性大鼠32只隨機分為側腦室注射雌二醇(E2)后應激組(WAS+E2)、側腦室注射E2后假應激組(shamWAS+E2)、側腦室注射生理鹽水后應激組(WAS+NS)、側腦室注射生理鹽水后假應激組(shamWAS+NS)。每次應激前30 min給予相應藥物側腦室注射，連續(xù)應激1O天，比較各組間應激前后內臟高敏感的變化。為進一步觀察雌激素對內臟高敏感形成的影響，將WAS+E2、WAS+NS兩組大鼠開胸心室取血用于CRF／ACTH放免測定，灌注固定取大腦c-fos免疫熒光染色，以及雙側腰1(L1)／骶1(s1)背根神經節(jié)(DRG)行P2X_3免疫熒光染色。比較WAS組和shamWAS組大鼠VMR、血漿CRF／ACTH、杏仁核及室旁核C-fos、DRG組織P2X_3表達的差異。 結果：卵巢切除后大鼠，應激(WAS+NS)組與假應激(shamWAS+NS)組之間，內臟敏感性沒有統(tǒng)計學差異。WAS+E2組內臟敏感性明顯高于wAS+NS組，提示給予雌激素后，心理應激大鼠內臟敏感性升高。WAS+E2組大鼠山漿CRF濃度為(36．81±11．1)pg／ml，與WAS+NS的血漿CRF濃度(45．78±14．55)pg／ml，沒有統(tǒng)計學差異。相似的，WAS+E2組大鼠血漿ACTH濃度為(77．81±17．20)pg／ml，與WAS+NS的血漿ACTH濃度(67．61±17．01)pg／ml，沒有顯著性差異。應激大鼠結直腸擴張后，杏仁核c-fos免疫陽性細胞數(shù)，WAS+E2組26．38±3．96明顯多于WAS+NS組19．28±4．54(p0．01)；而室旁核C-fos免疫陽性細胞數(shù)，WAS+E2組26．12±5．74，與WAS+NS組22．43±3．87比較，兩者之間沒有統(tǒng)計學差異(p0．05)。應激大鼠DRG的P2X_3陽性細胞數(shù)占所有細胞數(shù)的比值，WAS+E2組(33．2±2．85)％明顯多于WAS+NS組(38．38±3．31)％(p0．01) 小結：雌激素促進WAS大鼠內臟高敏感形成。雌激素不影響大鼠WAS后第4天血漿ACTH和CRF水平。雌激素增加WAS大鼠DRG的P2X_3受體表達。 3、雌激素對心理應激大鼠P2X_3、NR2B mRNA表達的影響 目的：P2X_3受體在DRG中表達，NR2B在DRG和前扣帶回(ACC)中均有表達。雌激素增加WAS大鼠內臟高敏感，本實驗進一步明確雌激素是否影響應激大鼠DRG組織P2X_3 mRNA，以及DRG、ACC組織NR2B mRNA的表達。 方法：將卵巢切除后雌性大鼠14只隨機分為：側腦室注射雌二醇后應激組(WAS+E2)、側腦室注射生理鹽水后應激組(WAS+NS)兩組大鼠。連續(xù)側腦室給藥、應激10天。剪取大鼠腰1(L1)至骶2(S2)所有DRG以及前扣帶回(ACC)組織，用real time PCR法比較DRG組織P2X_3、NR2B mRNA，以及ACC組織NR2BmRNA的水平。 結果：WAS+E2組大鼠DRG的P2X_3 mRNA表達明顯多于WAS+NS組大鼠(p0．05)。ACC組織NR2B mRNA，WAS+E2組高于WAS+NS組(p0．05)。而DRG組織NR2B mRNA，，WAS+E2組與WAS+NS組無顯著性差異。 小結：雌激素增加WAS大鼠ACC的NR2B mRNA，以及DRG的P2 X_3 mRNA表達，但對DRG的NR2B mRNA無影響。 4、雌激素核受體、NR2B拮抗劑對雌激素作用的影響 目的：應用雌激素核受體拮抗劑ICI 182，780、NMDA受體競爭性拮抗劑AP5、NR2B選擇性拮抗劑Ro25-6981，進一步闡明雌激素核受體、NR2B在雌激素促進心理應激內臟高敏感形成的作用。 方法：將雌性大鼠32只卵巢切除后，隨機分為側腦室注射E2及ICI 182,780后應激組(WAS+E2+ICI)、側腦室注射ICI 182，780后應激組(WAS+ICI)、側腦室注射E2及Ro25-6981后應激組(WAS+E2+Ro)、側腦室注射E2及AP5后應激組(WAS+E2+AP5)，連續(xù)側腦室給藥、應激1O天。各組與單用E2組(側腦室注射E2后應激WAS+E2組)、對照組(側腦室注射生理鹽水后應激WAS+NS組)的VMR相比較。 結果：與WAS+E2組比較，WAS+E2+ICI組只有在CRD 80mmHg壓力降低VMR幅度(p0．05)。WAS+E2+ICI組大鼠，在CRD 60mmHg、80mmHg壓力水平仍高于WAS+NS組大鼠的VMR幅度(p0．05)。WAS+E2+AP5組在60mmHg、80mmHg壓力水平VMR幅度明顯低于WAS+E2組大鼠。WAS+E2+Ro組在80mmHg壓力水平VMR幅度低于WAS+E2組大鼠(p0．01)。 小結：ICI 182，780阻斷雌激素增加WAS大鼠內臟高敏感的一部分作用。聯(lián)合應用AP5、Ro25-6981，阻斷E2促進內臟高敏感形成的作用。NR2B是參與E2促進內臟高敏感形成的重要信號傳導通路之一。 5、雌激素對大鼠急性結直腸擴張內臟痛的影響 目的：NR2B參與雌激素促進慢性心理應激內臟高敏感的形成，闡述的足雌激素慢性或長期的作用。本部分實驗分析雌激素的急性作用，觀察單次側腦室注射雌激素對大鼠急性結直腸擴張內臟痛的影響。 方法：(1)不同劑量E2對內臟痛敏感性的影響：卵巢切除后雌性大鼠24只，隨機分為側腦室注射高劑量E2 10 ug(H-E2組)、側腦室注射中劑量E2 1．0 ug(M-E2組)、側腦室注射低劑量E2 O．1ug(L-E2組)、側腦室注射對照NS(NS組)。分別比較注射30 min和4 h后的VMR幅度。(2)不同拮抗劑對中劑量E2作用的影響：卵巢切除后雌性大鼠24只，隨機分為側腦室注射E2 1．0 ug(E2組)、側腦室注射E2 1．0 ug和ICI 182，780(E2+ICI組)、側腦室注射E2 1．0 ug+Ro25-698(E2+Ro)、側腦室注射E21．0 ug+AP5(E2+AP5)。比較各組藥物側腦室注射30 min和4 h后的VMR幅度。 結果：(1)E2對非傷害性刺激20mmHg壓力VMR肌電曲線下面積沒有影響。E2劑量依賴性地增強CRD誘導的內臟傷害性刺激。高劑量組E2增加給藥后30min的40mmHg(P0．05)、60mmHg(PO．01)、80mmHg(P0．05)壓力VMR幅度。中劑量組E2增加給藥后4h的40mmHg、60mmHg、80mmHg壓力VMR幅度(均P0．05)，高劑量組E2增加給藥后4h的40mmHg(PO．05)、60mmHg(P0．01)、80mmHg(PO．05)壓力擴張VMR幅度。(2)ICI 182，780，AP5，Ro25-698，在側腦室注射30 min和4 h后，一定程度地抑制E2增加內臟高敏感。其中，以AP5最為明顯。 小結：側腦室注射雌激素增強大鼠急性結直腸擴張內臟痛敏感性，NR2B參與其調節(jié)作用機制。 結論 1、反復避水應激可引起雌性大鼠內臟高敏感。 2、雌激素促進慢性心理應激大鼠內臟高敏感的形成。 3、雌激素增加慢性心理應激大鼠DRG的P2X_3受體以及ACC組織NR2B表達。 4、NR2B參與雌激素介導心理應激內臟高敏感的形成。 5、側腦室注射雌激素增強急性結直腸擴張內臟痛敏感性，NR2B參與其調節(jié)作用。
【圖文】：

Sham-WAS組室旁核C-fosX200
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R574

【參考文獻】

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本文編號：2620451