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NR2B參與雌激素介導(dǎo)心理應(yīng)激內(nèi)臟高敏感的機(jī)制研究

發(fā)布時(shí)間：2020-04-09 07:00

【摘要】： 研究背景腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是臨床常見疾病之一。目前診斷仍然依靠癥狀、排他性診斷，缺乏生化標(biāo)志物及解剖學(xué)異常。內(nèi)臟高敏感是目前公認(rèn)的IBS重要病理生理機(jī)制之一。近來發(fā)現(xiàn)NMDA受體與內(nèi)臟高敏感的形成和維持密切相關(guān)。NMDA受體是興奮性氨基酸的特異性受體，參與體內(nèi)各種信號(hào)傳遞和調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性。其中,含2B亞基的NMDA受體(NR2B)在傷害性感受的傳遞和調(diào)制、中樞可塑性形成中發(fā)揮重要作用。流行病學(xué)研究提示IBS的發(fā)病以女性多見。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究亦表明皮下注射雌激素增加大鼠的內(nèi)臟敏感性。雌激素作用包括，通過雌激素受體的基因組效應(yīng)，和通過膜受體的非基因組效應(yīng)。雌激素對(duì)內(nèi)臟高敏感影響主要是通過何種效應(yīng)發(fā)揮作用尚不清楚。應(yīng)激是IBS癥狀發(fā)生或加重的一個(gè)重要因素，雌激素影響著對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)水平。雌激素是雌性大鼠急性束縛應(yīng)激引起內(nèi)臟敏感升高的必要因素。另外研究表明，避水應(yīng)激，作為一種心理應(yīng)激，可造成大鼠穩(wěn)定、持續(xù)約30大的內(nèi)臟高敏感。而雌激素是否影響慢性心理應(yīng)激內(nèi)臟高敏感形成，尚未見報(bào)道。為此，本課題以避水應(yīng)激為模型，研究雌激素對(duì)內(nèi)臟高敏感形成的影響，并通過雌激素受體拮抗劑ICI 182，780、NMDA受體競爭性拮抗劑AP5、NR2B選擇性拮抗劑Ro25-6981進(jìn)一步闡明雌激素作用機(jī)制。方法與結(jié)果 1、雌性大鼠內(nèi)臟高敏感模型的建立及檢測目的：我們首先觀察避水應(yīng)激是否引起正常雌性大鼠內(nèi)臟高敏感形成，以明確定避水應(yīng)激作為雌性大鼠內(nèi)臟高敏感造模方法的可行性。方法：通過埋置腹壁電極記錄20-40-60-80mmHg梯度壓力結(jié)直腸擴(kuò)張內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)反射(VMR)腹外斜肌收縮的肌電圖，計(jì)算曲線下面積，以VMR幅度值來評(píng)價(jià)大鼠的內(nèi)臟痛敏感性。將16只成年雌性大鼠隨機(jī)分成2組，避水應(yīng)激組(WAS)和假應(yīng)激組(shamWAS)，分別予分別避水應(yīng)激和假避水應(yīng)激。連續(xù)應(yīng)激10天，每天1小時(shí)。應(yīng)激前，測VMR基礎(chǔ)值；避水應(yīng)激完成后，繼續(xù)飼養(yǎng)4天，冉次測定后VMR幅度。開胸心室取血、以放射免疫法測定血漿CRF、ACTH的水平，灌注固定后取大腦用于c-fos免疫染色。比較WAS組和shamtWAS組大鼠VMR、血漿CRF和ACTH、杏仁核及室旁核c-Fos免疫陽性細(xì)胞(c-FLI)的差異。結(jié)果：WAS引起雌性大鼠內(nèi)臟高敏感，應(yīng)激大鼠結(jié)腸無病理學(xué)改變。大鼠經(jīng)反復(fù)避水應(yīng)激后，WAS大鼠血漿ACTH濃度(77．19±22．71)pg／ml，明顯低于假應(yīng)激組shamWAS的(148．71±50．37)pg／ml(P0．01)。WAS大鼠血漿CRF濃度35．41±22．71pg／ml，與假應(yīng)激組shamWAS的(43．82±14．76)pg／ml無明顯差異。WAS組大鼠室旁核c-FLI數(shù)24.33±4．93，與sham-WAS組22．14±3．82之間沒有顯著性差異(p0．05)。WAS組大鼠杏仁核c-FLI數(shù)25．64±5．39，明顯多于sham-WAS組19．62±3．62(p0．05)。小結(jié)：WAS可作為雌性大鼠內(nèi)臟高敏感造模方法。WAS后大鼠血漿ACTH水平降低，而CRF無變化。c-FLI數(shù)，在WAS大鼠杏仁核表達(dá)增加，而室旁核無變化。2、雌激素與內(nèi)臟高敏感形成關(guān)系的研究目的：P2X_3受體在介導(dǎo)痛覺中發(fā)揮重要作用。本部分實(shí)驗(yàn)觀察雌激素是否影響避水應(yīng)激大鼠內(nèi)臟高敏感的形成，以及P2X_3受體蛋白表達(dá)變化。方法：將卵巢切除后雌性大鼠32只隨機(jī)分為側(cè)腦室注射雌二醇(E2)后應(yīng)激組(WAS+E2)、側(cè)腦室注射E2后假應(yīng)激組(shamWAS+E2)、側(cè)腦室注射生理鹽水后應(yīng)激組(WAS+NS)、側(cè)腦室注射生理鹽水后假應(yīng)激組(shamWAS+NS)。每次應(yīng)激前30 min給予相應(yīng)藥物側(cè)腦室注射，連續(xù)應(yīng)激1O天，比較各組間應(yīng)激前后內(nèi)臟高敏感的變化。為進(jìn)一步觀察雌激素對(duì)內(nèi)臟高敏感形成的影響，將WAS+E2、WAS+NS兩組大鼠開胸心室取血用于CRF／ACTH放免測定，灌注固定取大腦c-fos免疫熒光染色，以及雙側(cè)腰1(L1)／骶1(s1)背根神經(jīng)節(jié)(DRG)行P2X_3免疫熒光染色。比較WAS組和shamWAS組大鼠VMR、血漿CRF／ACTH、杏仁核及室旁核C-fos、DRG組織P2X_3表達(dá)的差異。結(jié)果：卵巢切除后大鼠，應(yīng)激(WAS+NS)組與假應(yīng)激(shamWAS+NS)組之間，內(nèi)臟敏感性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。WAS+E2組內(nèi)臟敏感性明顯高于wAS+NS組，提示給予雌激素后，心理應(yīng)激大鼠內(nèi)臟敏感性升高。WAS+E2組大鼠山漿CRF濃度為(36．81±11．1)pg／ml，與WAS+NS的血漿CRF濃度(45．78±14．55)pg／ml，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。相似的，WAS+E2組大鼠血漿ACTH濃度為(77．81±17．20)pg／ml，與WAS+NS的血漿ACTH濃度(67．61±17．01)pg／ml，沒有顯著性差異。應(yīng)激大鼠結(jié)直腸擴(kuò)張后，杏仁核c-fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)，WAS+E2組26．38±3．96明顯多于WAS+NS組19．28±4．54(p0．01)；而室旁核C-fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)，WAS+E2組26．12±5．74，與WAS+NS組22．43±3．87比較，兩者之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0．05)。應(yīng)激大鼠DRG的P2X_3陽性細(xì)胞數(shù)占所有細(xì)胞數(shù)的比值，WAS+E2組(33．2±2．85)％明顯多于WAS+NS組(38．38±3．31)％(p0．01) 小結(jié)：雌激素促進(jìn)WAS大鼠內(nèi)臟高敏感形成。雌激素不影響大鼠WAS后第4天血漿ACTH和CRF水平。雌激素增加WAS大鼠DRG的P2X_3受體表達(dá)。 3、雌激素對(duì)心理應(yīng)激大鼠P2X_3、NR2B mRNA表達(dá)的影響目的：P2X_3受體在DRG中表達(dá)，NR2B在DRG和前扣帶回(ACC)中均有表達(dá)。雌激素增加WAS大鼠內(nèi)臟高敏感，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確雌激素是否影響應(yīng)激大鼠DRG組織P2X_3 mRNA，以及DRG、ACC組織NR2B mRNA的表達(dá)。方法：將卵巢切除后雌性大鼠14只隨機(jī)分為：側(cè)腦室注射雌二醇后應(yīng)激組(WAS+E2)、側(cè)腦室注射生理鹽水后應(yīng)激組(WAS+NS)兩組大鼠。連續(xù)側(cè)腦室給藥、應(yīng)激10天。剪取大鼠腰1(L1)至骶2(S2)所有DRG以及前扣帶回(ACC)組織，用real time PCR法比較DRG組織P2X_3、NR2B mRNA，以及ACC組織NR2BmRNA的水平。結(jié)果：WAS+E2組大鼠DRG的P2X_3 mRNA表達(dá)明顯多于WAS+NS組大鼠(p0．05)。ACC組織NR2B mRNA，WAS+E2組高于WAS+NS組(p0．05)。而DRG組織NR2B mRNA，，WAS+E2組與WAS+NS組無顯著性差異。小結(jié)：雌激素增加WAS大鼠ACC的NR2B mRNA，以及DRG的P2 X_3 mRNA表達(dá)，但對(duì)DRG的NR2B mRNA無影響。 4、雌激素核受體、NR2B拮抗劑對(duì)雌激素作用的影響目的：應(yīng)用雌激素核受體拮抗劑ICI 182，780、NMDA受體競爭性拮抗劑AP5、NR2B選擇性拮抗劑Ro25-6981，進(jìn)一步闡明雌激素核受體、NR2B在雌激素促進(jìn)心理應(yīng)激內(nèi)臟高敏感形成的作用。方法：將雌性大鼠32只卵巢切除后，隨機(jī)分為側(cè)腦室注射E2及ICI 182,780后應(yīng)激組(WAS+E2+ICI)、側(cè)腦室注射ICI 182，780后應(yīng)激組(WAS+ICI)、側(cè)腦室注射E2及Ro25-6981后應(yīng)激組(WAS+E2+Ro)、側(cè)腦室注射E2及AP5后應(yīng)激組(WAS+E2+AP5)，連續(xù)側(cè)腦室給藥、應(yīng)激1O天。各組與單用E2組(側(cè)腦室注射E2后應(yīng)激WAS+E2組)、對(duì)照組(側(cè)腦室注射生理鹽水后應(yīng)激WAS+NS組)的VMR相比較。結(jié)果：與WAS+E2組比較，WAS+E2+ICI組只有在CRD 80mmHg壓力降低VMR幅度(p0．05)。WAS+E2+ICI組大鼠，在CRD 60mmHg、80mmHg壓力水平仍高于WAS+NS組大鼠的VMR幅度(p0．05)。WAS+E2+AP5組在60mmHg、80mmHg壓力水平VMR幅度明顯低于WAS+E2組大鼠。WAS+E2+Ro組在80mmHg壓力水平VMR幅度低于WAS+E2組大鼠(p0．01)。小結(jié)：ICI 182，780阻斷雌激素增加WAS大鼠內(nèi)臟高敏感的一部分作用。聯(lián)合應(yīng)用AP5、Ro25-6981，阻斷E2促進(jìn)內(nèi)臟高敏感形成的作用。NR2B是參與E2促進(jìn)內(nèi)臟高敏感形成的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路之一。 5、雌激素對(duì)大鼠急性結(jié)直腸擴(kuò)張內(nèi)臟痛的影響目的：NR2B參與雌激素促進(jìn)慢性心理應(yīng)激內(nèi)臟高敏感的形成，闡述的足雌激素慢性或長期的作用。本部分實(shí)驗(yàn)分析雌激素的急性作用，觀察單次側(cè)腦室注射雌激素對(duì)大鼠急性結(jié)直腸擴(kuò)張內(nèi)臟痛的影響。方法：(1)不同劑量E2對(duì)內(nèi)臟痛敏感性的影響：卵巢切除后雌性大鼠24只，隨機(jī)分為側(cè)腦室注射高劑量E2 10 ug(H-E2組)、側(cè)腦室注射中劑量E2 1．0 ug(M-E2組)、側(cè)腦室注射低劑量E2 O．1ug(L-E2組)、側(cè)腦室注射對(duì)照NS(NS組)。分別比較注射30 min和4 h后的VMR幅度。(2)不同拮抗劑對(duì)中劑量E2作用的影響：卵巢切除后雌性大鼠24只，隨機(jī)分為側(cè)腦室注射E2 1．0 ug(E2組)、側(cè)腦室注射E2 1．0 ug和ICI 182，780(E2+ICI組)、側(cè)腦室注射E2 1．0 ug+Ro25-698(E2+Ro)、側(cè)腦室注射E21．0 ug+AP5(E2+AP5)。比較各組藥物側(cè)腦室注射30 min和4 h后的VMR幅度。結(jié)果：(1)E2對(duì)非傷害性刺激20mmHg壓力VMR肌電曲線下面積沒有影響。E2劑量依賴性地增強(qiáng)CRD誘導(dǎo)的內(nèi)臟傷害性刺激。高劑量組E2增加給藥后30min的40mmHg(P0．05)、60mmHg(PO．01)、80mmHg(P0．05)壓力VMR幅度。中劑量組E2增加給藥后4h的40mmHg、60mmHg、80mmHg壓力VMR幅度(均P0．05)，高劑量組E2增加給藥后4h的40mmHg(PO．05)、60mmHg(P0．01)、80mmHg(PO．05)壓力擴(kuò)張VMR幅度。(2)ICI 182，780，AP5，Ro25-698，在側(cè)腦室注射30 min和4 h后，一定程度地抑制E2增加內(nèi)臟高敏感。其中，以AP5最為明顯。小結(jié)：側(cè)腦室注射雌激素增強(qiáng)大鼠急性結(jié)直腸擴(kuò)張內(nèi)臟痛敏感性，NR2B參與其調(diào)節(jié)作用機(jī)制。結(jié)論 1、反復(fù)避水應(yīng)激可引起雌性大鼠內(nèi)臟高敏感。 2、雌激素促進(jìn)慢性心理應(yīng)激大鼠內(nèi)臟高敏感的形成。 3、雌激素增加慢性心理應(yīng)激大鼠DRG的P2X_3受體以及ACC組織NR2B表達(dá)。 4、NR2B參與雌激素介導(dǎo)心理應(yīng)激內(nèi)臟高敏感的形成。 5、側(cè)腦室注射雌激素增強(qiáng)急性結(jié)直腸擴(kuò)張內(nèi)臟痛敏感性，NR2B參與其調(diào)節(jié)作用。
【圖文】：

室旁核