【摘要】： 目的:構(gòu)建融合基因超級白介素6(Hyper-inerleukin-6,HIL-6),應(yīng)用貓免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus,FIV)為基礎(chǔ)的慢病毒載體構(gòu)建重組慢病毒FIV-HIL-6。用FIV-HIL-6感染人肝細(xì)胞HepG2,觀察細(xì)胞內(nèi)Hyper-IL-6 mRNA的表達(dá)情況。 方法:采用基因拼接(GeneSOEing)的方法將人類sIL-6R和IL-6的基因用富含甘氨酸序列的接頭經(jīng)PCR擴(kuò)增融合,并定向克隆至慢病毒載體的表達(dá)質(zhì)粒pCDEF,再將表達(dá)質(zhì)粒pCDEF-HIL-6和慢病毒載體的包裝質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,構(gòu)建慢病毒載體FIV-HIL-6的包裝體系。嘌呤霉素篩選的方法檢測Hyper-IL-6重組慢病毒的病毒滴度。RT-PCR檢測FIV-HIL-6感染靶細(xì)胞HepG2細(xì)胞后Hyper-IL-6基因的表達(dá)情況。 結(jié)果:PCR擴(kuò)增出1560bp的Hyper-IL-6編碼序列并成功構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒pCDEF-HIL-6,經(jīng)鑒定證實(shí)構(gòu)建的融合基因的編碼序列與理論推斷完全一致。重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pCDEF-HIL-6經(jīng)BglII和EcoRI雙酶切后,可見一條約1560kb的目的基因條帶和質(zhì)粒的條帶,表明同源重組成功。將重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,于熒光顯微鏡下可見綠色熒光。收集細(xì)胞上清液,得到重組慢病毒顆粒FIV-HIL-6,用嘌呤霉素篩選測定病毒滴度為107pfu/ml。將重組慢病毒顆粒感染肝癌細(xì)胞HepG2,并提取細(xì)胞總RNA,用RT-PCR方法能檢測到HepG2細(xì)胞中表達(dá)出的Hyper-IL-6基因。 結(jié)論:成功構(gòu)建了重組慢病毒Hyper-IL-6,并在人肝腫瘤細(xì)胞HepG2中得到了Hyper-IL-6基因的表達(dá),為以后進(jìn)行急性肝衰竭的基因治療等研究奠定了一定基礎(chǔ)。 目的:研究重組慢病毒FIV-HIL-6對人正常肝細(xì)胞L-02中急性時(shí)相蛋白——結(jié)合珠蛋白(Haptoglobin)mRNA表達(dá)的影響作用;同時(shí)觀察Hyper-IL-6對L-02細(xì)胞促增殖作用的影響。 方法:重組慢病毒FIV-HIL-6感染L-02細(xì)胞后,提取細(xì)胞總RNA,用RT-PCR方法檢測結(jié)合珠蛋白的mRNA表達(dá)量的變化。用MTT法檢測并分析FIV-HIL-6對L-02細(xì)胞生長狀態(tài)的影響。 結(jié)果:人正常肝細(xì)胞L-02在重組慢病毒FIV-HIL-6刺激下,L-02細(xì)胞的結(jié)合珠蛋白mRNA表達(dá)相對于未感染組、空病毒組(FIV組)及FIV-IL-6組有顯著增高(F=7.85)。FIV-HIL-6組對L-02細(xì)胞的促增殖作用也明顯高于對照組(p=0.0000)。 結(jié)論:重組慢病毒FIV-HIL-6表達(dá)的Hyper-IL-6有顯著的生物活性,能夠顯著刺激人正常肝細(xì)胞L-02結(jié)合珠蛋白mRNA的表達(dá);并且對L-02細(xì)胞有顯著的促增殖作用。
【圖文】：

1-1 總 RNA 瓊脂糖凝膠電arose gel electrophresis o-6 的構(gòu)建R 擴(kuò)增后得到 1008bpP4 引物擴(kuò)增出 591bp CR 產(chǎn)物為模板，用引 1-2）。

圖 1-1 總 RNA 瓊脂糖凝膠電泳Fig1-1 1% Agarose gel electrophresis of the total RNA.1.2 融合基因 Hyper-IL-6 的構(gòu)建以 P1、P2 為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增后得到 1008bp 大小的特異性條帶（sIL-6R碼基因加 Linker），，用 P3、P4 引物擴(kuò)增出 591bp 的目的條帶（Linker 加 IL-碼基因），再以上述兩次 PCR 產(chǎn)物為模板，用引物 P1、P4 擴(kuò)增得到 1560byper-IL-6 融合基因片段（圖 1-2）。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R575

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2 陳

本文編號(hào)：2620133