【摘要】： 目的:構建融合基因超級白介素6(Hyper-inerleukin-6,HIL-6),應用貓免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus,FIV)為基礎的慢病毒載體構建重組慢病毒FIV-HIL-6。用FIV-HIL-6感染人肝細胞HepG2,觀察細胞內Hyper-IL-6 mRNA的表達情況。 方法:采用基因拼接(GeneSOEing)的方法將人類sIL-6R和IL-6的基因用富含甘氨酸序列的接頭經PCR擴增融合,并定向克隆至慢病毒載體的表達質粒pCDEF,再將表達質粒pCDEF-HIL-6和慢病毒載體的包裝質粒瞬時共轉染293T細胞,構建慢病毒載體FIV-HIL-6的包裝體系。嘌呤霉素篩選的方法檢測Hyper-IL-6重組慢病毒的病毒滴度。RT-PCR檢測FIV-HIL-6感染靶細胞HepG2細胞后Hyper-IL-6基因的表達情況。 結果:PCR擴增出1560bp的Hyper-IL-6編碼序列并成功構建重組慢病毒質粒pCDEF-HIL-6,經鑒定證實構建的融合基因的編碼序列與理論推斷完全一致。重組慢病毒表達質粒pCDEF-HIL-6經BglII和EcoRI雙酶切后,可見一條約1560kb的目的基因條帶和質粒的條帶,表明同源重組成功。將重組慢病毒表達質粒和包裝質粒瞬時共轉染293T細胞后,于熒光顯微鏡下可見綠色熒光。收集細胞上清液,得到重組慢病毒顆粒FIV-HIL-6,用嘌呤霉素篩選測定病毒滴度為107pfu/ml。將重組慢病毒顆粒感染肝癌細胞HepG2,并提取細胞總RNA,用RT-PCR方法能檢測到HepG2細胞中表達出的Hyper-IL-6基因。 結論:成功構建了重組慢病毒Hyper-IL-6,并在人肝腫瘤細胞HepG2中得到了Hyper-IL-6基因的表達,為以后進行急性肝衰竭的基因治療等研究奠定了一定基礎。 目的:研究重組慢病毒FIV-HIL-6對人正常肝細胞L-02中急性時相蛋白——結合珠蛋白(Haptoglobin)mRNA表達的影響作用;同時觀察Hyper-IL-6對L-02細胞促增殖作用的影響。 方法:重組慢病毒FIV-HIL-6感染L-02細胞后,提取細胞總RNA,用RT-PCR方法檢測結合珠蛋白的mRNA表達量的變化。用MTT法檢測并分析FIV-HIL-6對L-02細胞生長狀態(tài)的影響。 結果:人正常肝細胞L-02在重組慢病毒FIV-HIL-6刺激下,L-02細胞的結合珠蛋白mRNA表達相對于未感染組、空病毒組(FIV組)及FIV-IL-6組有顯著增高(F=7.85)。FIV-HIL-6組對L-02細胞的促增殖作用也明顯高于對照組(p=0.0000)。 結論:重組慢病毒FIV-HIL-6表達的Hyper-IL-6有顯著的生物活性,能夠顯著刺激人正常肝細胞L-02結合珠蛋白mRNA的表達;并且對L-02細胞有顯著的促增殖作用。
【圖文】：

1-1 總 RNA 瓊脂糖凝膠電arose gel electrophresis o-6 的構建R 擴增后得到 1008bpP4 引物擴增出 591bp CR 產物為模板，用引 1-2）。

圖 1-1 總 RNA 瓊脂糖凝膠電泳Fig1-1 1% Agarose gel electrophresis of the total RNA.1.2 融合基因 Hyper-IL-6 的構建以 P1、P2 為引物進行 PCR 擴增后得到 1008bp 大小的特異性條帶（sIL-6R碼基因加 Linker），，用 P3、P4 引物擴增出 591bp 的目的條帶（Linker 加 IL-碼基因），再以上述兩次 PCR 產物為模板，用引物 P1、P4 擴增得到 1560byper-IL-6 融合基因片段（圖 1-2）。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R575

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本文編號：2620133