【摘要】：肝纖維化是由病毒性肝炎,酗酒,代謝性疾病,自身免疫性疾病和膽汁淤積性肝病等持續(xù)肝損傷引起。在肝纖維化進(jìn)展過(guò)程中,炎癥和肝損傷引起復(fù)雜的細(xì)胞活動(dòng),導(dǎo)致膠原蛋白沉積和正常肝臟結(jié)構(gòu)的破壞。在過(guò)去幾十年,竇狀靜脈的肝星狀細(xì)胞(HSC)被認(rèn)為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要來(lái)源。在正常肝臟中,HSC是靜息的,儲(chǔ)存維生素A的脂肪細(xì)胞。然而,在肝纖維化后,HSC從靜息的維生素A儲(chǔ)存細(xì)胞到活化的肌成纖維細(xì)胞形態(tài)變化等相關(guān)的激活過(guò)程。此外,HSC活化與ECM組分合成和沉積顯著相關(guān),比如上調(diào)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA),膠原,金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP1),產(chǎn)生促纖維化細(xì)胞因子/生長(zhǎng),諸如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β),血小板衍生因子等。然而,調(diào)控HSC活化和肝纖維化的分子機(jī)制還未闡明。我們課題組最近的研究表明lnc RNA在HSC活化和肝纖維化中具有重要的作用。LncRNA是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt的RNA分子。最初,lnc RNA被認(rèn)為是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物,并無(wú)生物學(xué)功能。然而,近年的研究表明,lnc RNA在生物體重要生命活動(dòng)中發(fā)揮著極廣泛的調(diào)控作用,可通過(guò)參與m RNA的穩(wěn)定和翻譯水平的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的運(yùn)輸、RNA的加工和修飾、影響染色體的結(jié)構(gòu)等機(jī)制,調(diào)控生物體的胚胎發(fā)育、組織分化、器官形成等基本的生命活動(dòng),并參與腫瘤等疾病的病程相關(guān)過(guò)程。LncRNAs可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)miRNA、DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu),在疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有發(fā)揮重要作用。HOX轉(zhuǎn)錄本反義基因RNA(HOTAIR)位于染色體12q13.13上,長(zhǎng)度為2158bp,在轉(zhuǎn)錄沉默中具有重要作用。HOTAIR能作用于核心蛋白復(fù)合體PRC2,改變H3K27甲基化和基因表達(dá)方式,導(dǎo)致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移性增強(qiáng)。HOTAIR在不同類(lèi)型的癌癥(包括乳腺癌,結(jié)腸癌和肝癌)中高度表達(dá),并且HOTAIR表達(dá)與乳腺癌,結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)。HOTAIR表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和胃癌TNM分期顯著相關(guān)。此外,敲減HOTAIR抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR在肝癌中高表達(dá),并且HOTAIR表達(dá)與肝癌患者存活負(fù)相關(guān)。但是HOTAIR在肝纖維化,尤其是對(duì)HSC的活化的相關(guān)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。于是本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究HOTAIR在肝纖維化中的作用,尤其是對(duì)HSC活化增殖中的作用,為肝纖維化防治提供新的思路,闡明肝纖維化形成中相關(guān)的分子機(jī)制,對(duì)抗肝纖維化藥物的研發(fā),減少肝硬化及原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生具有十分重要的意義。主要研究?jī)?nèi)容概括如下:1.Hotair在纖維化的肝組織中表達(dá)上調(diào)首先檢測(cè)CCl4處理的肝纖維化小鼠模型中Hotair的表達(dá)。采用免疫組化、熒光雙染、RT-q PCR等方法檢測(cè)Hotair的表達(dá)變化。另選取人體肝血管瘤組織作為正常對(duì)照組,肝癌患者癌旁2 cm以外作為肝纖維化組織。并使用免疫組化、熒光雙染、RT-q PCR方法觀察Hotair的表達(dá)及定位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常肝組織相比,人體肝纖維化組織及小鼠肝纖維化組織中Hotair的表達(dá)明顯增高,且主要表達(dá)于肝星狀細(xì)胞。2.Hotair對(duì)HSCs活化的影響體外實(shí)驗(yàn)部分以人肝星狀細(xì)胞株LX-2(活化的HSC)為研究對(duì)象,通過(guò)si-Hotair和Hotair過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞,利用CCK8實(shí)驗(yàn)觀察LX-2細(xì)胞增殖情況;利用RT-q PCR和western blot觀察LX-2細(xì)胞活化的情況。結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,Hotair過(guò)表達(dá)促進(jìn)LX-2細(xì)胞增殖和活化,而敲減Hotair抑制LX-2細(xì)胞增殖和活化。3.Hotair作為miR-148b的ce RNA促進(jìn)DNMT1的表達(dá)進(jìn)一步我們利用生物信息學(xué)方法結(jié)合熒光素酶報(bào)告基因,研究miR-148b是否靶向抑制Hotair和DNMT1。利用RT-q PCR和熒光素酶報(bào)告基因觀察過(guò)表達(dá)miR-148b或抑制miR-148b對(duì)Hotair表達(dá)及熒光素酶活性的影響。結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,過(guò)表達(dá)miR-148b導(dǎo)致Hotair熒光素酶活性和表達(dá)的減少,而抑制miR-148b誘導(dǎo)Hotair熒光素酶活性和表達(dá)的增加。此外,miR-148b顯著抑制DNMT1的表達(dá)和熒光素酶活性。進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶,RT-q PCR和western blot檢測(cè)表明,與對(duì)照組相比,在Hotair存在下,RLuc-DNMT1 3'-UTR抑制被逆轉(zhuǎn),同時(shí)DNMT1表達(dá)被逆轉(zhuǎn)。4.Hotair通過(guò)抑制MEG3/p53促進(jìn)HSC活化為進(jìn)一步探討Hotair影響HSC功能的相關(guān)分子機(jī)制,我們利用共轉(zhuǎn)染技術(shù),RT-q PCR和western blot研究MEG3是否參與Hotair對(duì)HSC的功能影響。敲減Hotair上調(diào)LX-2細(xì)胞中MEG3/p53表達(dá),而過(guò)表達(dá)Hotair抑制MEG3/p53表達(dá)。此外,我們利用Hotair和MEG3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞,CCK8實(shí)驗(yàn),RT-q PCR和western blot方法觀察LX-2的增殖和活化的情況。結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,Hotair的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)了LX-2的增殖和活化,而MEG3過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)Hotair介導(dǎo)的LX-2增殖和活化。5.Hotair/DNA通過(guò)PRC2抑制MEG3促進(jìn)HSC活化為探討Hotair是否通過(guò)互作組蛋白修飾(特別PRC2)調(diào)控基因的表達(dá),我們利用CHIP-PCR,RNA免疫共沉淀,RT-q PCR和western blot等方法研究Hotair如何調(diào)控MEG3。結(jié)果顯示,PRC2復(fù)合物EZH2和SUZ12能與Hotair結(jié)合。Hotair質(zhì)粒和si-EZH2或si-SUZ12共轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞檢測(cè)MEG3的表達(dá)水平,結(jié)果顯示Hotair過(guò)度表達(dá)抑制MEG3的表達(dá),而si-EZH2或si-SUZ12部分逆轉(zhuǎn)Hotair介導(dǎo)的MEG3減少。此外,在LX-2細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)Hotair誘導(dǎo)組蛋白H3K27me3顯著富集在MEG3啟動(dòng)子。最重要的是,RNase Ch IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,RNase抑制劑處理后最大程度招募PRC2到MEG3啟動(dòng)子區(qū)域。用RNA酶H處理部分減少PRC2到MEG3啟動(dòng)子區(qū)域,而RNA酶A處理沒(méi)有顯著的抑制作用。
【圖文】：

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文-SMA陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加(Fig.1B)。如Fig.1C所示，RT-qPCR結(jié)果顯示，CCl4處理的小鼠肝組織中α-SMA和Col1A1 mRNA表達(dá)顯著增加，與正常組比較差異有顯著性(p<0.01)。如Fig.1D所示，Western blot結(jié)果顯示，模型組的肝組織中α-SMA和Col1A1 蛋白表達(dá)顯著增加，與正常組比較差異有顯著性（p<0.01）。如Fig.1E所示，RT-qPCR結(jié)果顯示，，與對(duì)照組比較，CCl4處理2周和4周的小鼠中Hotair表達(dá)沒(méi)有顯著變化（p>0.05），但在6周Hotair表達(dá)顯著增加(p<0.01)。為確定Hotair的上調(diào)是否發(fā)生在小鼠HSC或肝臟中的其他細(xì)胞類(lèi)型，我們用Hotai（Hotair探針）和α-SMA（anti-α-SMA）進(jìn)行了免疫熒光雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。 免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)顯示，活化的HSC（α-SMA陽(yáng)性）在實(shí)驗(yàn)組小鼠肝纖維化的纖維束中表達(dá)高水平Hotair，而在正常小鼠肝臟中靜息的HSC表達(dá)低水平的Hotair(Fig.1F)。上述結(jié)果提示Hotair可能主要定位在活化的HSC中。

圖2. Hotair在人纖維化肝組織中的表達(dá)情況。Fig.2. Hotair expression in human liver fibrosis tissues, n=6 per group. (A) Pathology observation the patient liver sections stained with H&E staining and Sirium red (×100). The level of α-SMA wanalyzed by immunohistochemistry. Representative views from each group are presented (×100). (qRT-PCR analyzed mRNA expression of α-SMA and Col1A1 in human fibrotic liver tissue*p<0.05, **p<0.01 vs. control. (C) The protein expression of α-SMA and Col1A1 was analyzed bwestern blot in fibrotic liver tissues and control liver tissues. **p<0.01 vs. control. (D) Hotaexpression in human liver fibrotic tissues and control liver tissues. **p<0.01 vs. control. (F) ISwith anti-Hotair probe and IHC with α-SMA were performed to determine the co-localization Hotair (green) and α-SMA (red) in human liver fibrosis models(×400).
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2

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本文編號(hào)：2620094