【摘要】：肝纖維化是由病毒性肝炎,酗酒,代謝性疾病,自身免疫性疾病和膽汁淤積性肝病等持續(xù)肝損傷引起。在肝纖維化進展過程中,炎癥和肝損傷引起復雜的細胞活動,導致膠原蛋白沉積和正常肝臟結構的破壞。在過去幾十年,竇狀靜脈的肝星狀細胞(HSC)被認為細胞外基質(ECM)的主要來源。在正常肝臟中,HSC是靜息的,儲存維生素A的脂肪細胞。然而,在肝纖維化后,HSC從靜息的維生素A儲存細胞到活化的肌成纖維細胞形態(tài)變化等相關的激活過程。此外,HSC活化與ECM組分合成和沉積顯著相關,比如上調α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA),膠原,金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP1),產生促纖維化細胞因子/生長,諸如轉化生長因子-β(TGF-β),血小板衍生因子等。然而,調控HSC活化和肝纖維化的分子機制還未闡明。我們課題組最近的研究表明lnc RNA在HSC活化和肝纖維化中具有重要的作用。LncRNA是一類轉錄本長度超過200nt的RNA分子。最初,lnc RNA被認為是RNA聚合酶II轉錄的副產物,并無生物學功能。然而,近年的研究表明,lnc RNA在生物體重要生命活動中發(fā)揮著極廣泛的調控作用,可通過參與m RNA的穩(wěn)定和翻譯水平的調節(jié)、蛋白質的運輸、RNA的加工和修飾、影響染色體的結構等機制,調控生物體的胚胎發(fā)育、組織分化、器官形成等基本的生命活動,并參與腫瘤等疾病的病程相關過程。LncRNAs可通過多種途徑調節(jié)miRNA、DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重構,在疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有發(fā)揮重要作用。HOX轉錄本反義基因RNA(HOTAIR)位于染色體12q13.13上,長度為2158bp,在轉錄沉默中具有重要作用。HOTAIR能作用于核心蛋白復合體PRC2,改變H3K27甲基化和基因表達方式,導致腫瘤侵襲和轉移性增強。HOTAIR在不同類型的癌癥(包括乳腺癌,結腸癌和肝癌)中高度表達,并且HOTAIR表達與乳腺癌,結腸癌預后相關。HOTAIR表達與淋巴結轉移和胃癌TNM分期顯著相關。此外,敲減HOTAIR抑制胃癌細胞的侵襲轉移能力。研究發(fā)現HOTAIR在肝癌中高表達,并且HOTAIR表達與肝癌患者存活負相關。但是HOTAIR在肝纖維化,尤其是對HSC的活化的相關作用尚未見報道。于是本實驗重點研究HOTAIR在肝纖維化中的作用,尤其是對HSC活化增殖中的作用,為肝纖維化防治提供新的思路,闡明肝纖維化形成中相關的分子機制,對抗肝纖維化藥物的研發(fā),減少肝硬化及原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生具有十分重要的意義。主要研究內容概括如下:1.Hotair在纖維化的肝組織中表達上調首先檢測CCl4處理的肝纖維化小鼠模型中Hotair的表達。采用免疫組化、熒光雙染、RT-q PCR等方法檢測Hotair的表達變化。另選取人體肝血管瘤組織作為正常對照組,肝癌患者癌旁2 cm以外作為肝纖維化組織。并使用免疫組化、熒光雙染、RT-q PCR方法觀察Hotair的表達及定位情況。結果發(fā)現,與正常肝組織相比,人體肝纖維化組織及小鼠肝纖維化組織中Hotair的表達明顯增高,且主要表達于肝星狀細胞。2.Hotair對HSCs活化的影響體外實驗部分以人肝星狀細胞株LX-2(活化的HSC)為研究對象,通過si-Hotair和Hotair過表達質粒轉染LX-2細胞,利用CCK8實驗觀察LX-2細胞增殖情況;利用RT-q PCR和western blot觀察LX-2細胞活化的情況。結果表明,與對照組比較,Hotair過表達促進LX-2細胞增殖和活化,而敲減Hotair抑制LX-2細胞增殖和活化。3.Hotair作為miR-148b的ce RNA促進DNMT1的表達進一步我們利用生物信息學方法結合熒光素酶報告基因,研究miR-148b是否靶向抑制Hotair和DNMT1。利用RT-q PCR和熒光素酶報告基因觀察過表達miR-148b或抑制miR-148b對Hotair表達及熒光素酶活性的影響。結果表明,與對照組比較,過表達miR-148b導致Hotair熒光素酶活性和表達的減少,而抑制miR-148b誘導Hotair熒光素酶活性和表達的增加。此外,miR-148b顯著抑制DNMT1的表達和熒光素酶活性。進一步通過熒光素酶,RT-q PCR和western blot檢測表明,與對照組相比,在Hotair存在下,RLuc-DNMT1 3'-UTR抑制被逆轉,同時DNMT1表達被逆轉。4.Hotair通過抑制MEG3/p53促進HSC活化為進一步探討Hotair影響HSC功能的相關分子機制,我們利用共轉染技術,RT-q PCR和western blot研究MEG3是否參與Hotair對HSC的功能影響。敲減Hotair上調LX-2細胞中MEG3/p53表達,而過表達Hotair抑制MEG3/p53表達。此外,我們利用Hotair和MEG3質粒共轉染LX-2細胞,CCK8實驗,RT-q PCR和western blot方法觀察LX-2的增殖和活化的情況。結果表明,與對照組比較,Hotair的過度表達促進了LX-2的增殖和活化,而MEG3過表達逆轉Hotair介導的LX-2增殖和活化。5.Hotair/DNA通過PRC2抑制MEG3促進HSC活化為探討Hotair是否通過互作組蛋白修飾(特別PRC2)調控基因的表達,我們利用CHIP-PCR,RNA免疫共沉淀,RT-q PCR和western blot等方法研究Hotair如何調控MEG3。結果顯示,PRC2復合物EZH2和SUZ12能與Hotair結合。Hotair質粒和si-EZH2或si-SUZ12共轉染LX-2細胞檢測MEG3的表達水平,結果顯示Hotair過度表達抑制MEG3的表達,而si-EZH2或si-SUZ12部分逆轉Hotair介導的MEG3減少。此外,在LX-2細胞中,過表達Hotair誘導組蛋白H3K27me3顯著富集在MEG3啟動子。最重要的是,RNase Ch IP實驗結果顯示,RNase抑制劑處理后最大程度招募PRC2到MEG3啟動子區(qū)域。用RNA酶H處理部分減少PRC2到MEG3啟動子區(qū)域,而RNA酶A處理沒有顯著的抑制作用。
【圖文】：

安徽醫(yī)科大學博士學位論文-SMA陽性細胞顯著增加(Fig.1B)。如Fig.1C所示，RT-qPCR結果顯示，CCl4處理的小鼠肝組織中α-SMA和Col1A1 mRNA表達顯著增加，與正常組比較差異有顯著性(p<0.01)。如Fig.1D所示，Western blot結果顯示，模型組的肝組織中α-SMA和Col1A1 蛋白表達顯著增加，與正常組比較差異有顯著性（p<0.01）。如Fig.1E所示，RT-qPCR結果顯示，，與對照組比較，CCl4處理2周和4周的小鼠中Hotair表達沒有顯著變化（p>0.05），但在6周Hotair表達顯著增加(p<0.01)。為確定Hotair的上調是否發(fā)生在小鼠HSC或肝臟中的其他細胞類型，我們用Hotai（Hotair探針）和α-SMA（anti-α-SMA）進行了免疫熒光雙標記實驗。 免疫熒光雙標實驗顯示，活化的HSC（α-SMA陽性）在實驗組小鼠肝纖維化的纖維束中表達高水平Hotair，而在正常小鼠肝臟中靜息的HSC表達低水平的Hotair(Fig.1F)。上述結果提示Hotair可能主要定位在活化的HSC中。

圖2. Hotair在人纖維化肝組織中的表達情況。Fig.2. Hotair expression in human liver fibrosis tissues, n=6 per group. (A) Pathology observation the patient liver sections stained with H&E staining and Sirium red (×100). The level of α-SMA wanalyzed by immunohistochemistry. Representative views from each group are presented (×100). (qRT-PCR analyzed mRNA expression of α-SMA and Col1A1 in human fibrotic liver tissue*p<0.05, **p<0.01 vs. control. (C) The protein expression of α-SMA and Col1A1 was analyzed bwestern blot in fibrotic liver tissues and control liver tissues. **p<0.01 vs. control. (D) Hotaexpression in human liver fibrotic tissues and control liver tissues. **p<0.01 vs. control. (F) ISwith anti-Hotair probe and IHC with α-SMA were performed to determine the co-localization Hotair (green) and α-SMA (red) in human liver fibrosis models(×400).
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R575.2

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本文編號：2620094