【摘要】：乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus,HBV)引起的一種傳染病,全球范圍內(nèi)普遍存在且嚴(yán)重影響人類健康。HBV感染對肝臟可引起不同程度的損害,包括急性自愈性感染、慢性肝炎、暴發(fā)性肝炎、肝硬化和肝癌。目前,以乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B Surface Antigen,HBsAg)作為基礎(chǔ),將 HBV 分為 adw、adr、ayw 和 ayr四個主要的血清型,同時,根據(jù)全基因組核苷酸序列的差異將HBV分為A～19個基因型。目前的很多研究表明,HBV血清型與基因型在乙肝臨床表現(xiàn)、病情進(jìn)展、對干擾素治療和預(yù)后等方面都有不可忽視的影響。HBV的血清型與基因型在不同的人種及地區(qū)之間的分布有所差異,而研究探討這部分內(nèi)容則有助于對HBV的臨床結(jié)局分析、抗病毒療效以及HBV基因突變位點的分析,對進(jìn)一步認(rèn)識HBV的生物學(xué)特性具有重要意義。本研究將建立一種特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高的檢測HBV血清型的ELISA方法,探討我國乙肝患者HBV血清型及基因型的分布特點及其與臨床的關(guān)系,具體進(jìn)行以下方面的研究:1.建立分泌抗HBsAg表位單克隆抗體細(xì)胞株以HBsAg亞型蛋白adr、adw、ay作為抗原免疫小鼠。經(jīng)過三次免疫后,小鼠尾部血清效價在1×10-4左右。經(jīng)過細(xì)胞融合技術(shù)和雜交瘤篩選技術(shù),篩選出4株分泌特異性識別HBsAg表位“d”、“y”、“r”、“w”抗體的雜交瘤細(xì)胞株,代號分別為#2.1-4.2、#7-7-2、#18.1-23-3.1 和#56.2-71-5.2。2.抗HBsAg表位單克隆抗體的獲得將4株細(xì)胞株在無血清培養(yǎng)基MD6中大量培養(yǎng),通過Protein A進(jìn)行親和層析純化,獲得單克隆抗體。利用間接ELISA方法對獲得的四株單克隆抗體的特異性進(jìn)行分析,結(jié)果表明#2.1-4.2特異性識別HBsAg“d”表位,#7-7-2特異性識別HBsAg“y”表位,#18.1-23-3.1特異性識別HBsAg“r”表位,#56.2-71-5.2特異性識別HBsAg“w”表位。另外,#2.1-4.2 與#7-7-2 不競爭同一表位,#18.1-23-3.1 與#56.2-71-5.2 不競爭同一表位。四株抗體的親和力均在109L/mol以上。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示,抗體輕、重鏈條帶明顯,無其它雜帶。#2.1-4.2、#18.1-23-3.1及#56.2-71-5.2的單克隆抗體重鏈亞型為IgG2b,#7-7-2的重鏈亞型為IgG1,四株單克隆抗體的輕鏈亞型均為κ。我們根據(jù)HBsAg血清型氨基酸序列設(shè)計了四條多肽序列R1、W1與R2、W2,利用ELISA方法鑒定抗體的抗抗原位點。結(jié)果顯示,#18.1-23-3.1抗體相對應(yīng)的抗原位點可能是R1的氨基酸序列,#56.2-71-5.2抗體相對應(yīng)的抗原位點可能是W1的氨基酸序列。3.特異性HBV血清型檢測方法的建立利用以上四株單克隆抗體為原料建立一種特異性HBV血清型檢測方法,并對包被濃度、HRP二抗使用濃度、反應(yīng)溫度及時間進(jìn)行了優(yōu)化,檢測各ELISA的靈敏度及特異性。首先,將四種單克隆抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記,計算出最佳工作濃度后(1:8,000),與抗“a”表位的單克隆抗體#3-11-2.1分別組合成雙抗體夾心ELISA。經(jīng)過對ELISA條件的優(yōu)化及比較,結(jié)果顯示,#3-11-2.1的最佳包被濃度為1.0 μg/mL,樣本最佳加樣量為10μL;ELISA樣本反應(yīng)溫度為37℃,反應(yīng)時間為30 min,且一步法ELISAL比兩步法ELISA檢測的準(zhǔn)確率高。對建立的檢測方法做出以下評價:(1)特異性較高,#3-11-2.1抗體包被,#2.1-4.2-HRP作為二抗的夾心ELISA方法能特異性地檢測“d”表位;同樣,#3-11-2.1包被,#7-7-2-HRP的夾心ELISA能特異性地檢測“y”表位;#3-11-2.1包被,#18.1-23-3.1-HRP 的夾心 ELISA 檢測“r”表位;#3-11-2.1 包被,#56.2-71-5.2-HRP 的夾心 ELISA 能特異性地檢測“w”表位。(2)四種夾心方法都具有良好的線性區(qū)間,R值均在0.99以上,靈敏度在納克級水平,批內(nèi)變異系數(shù)均在10%以下,批間變異系數(shù)均在15%以下。(3)與PCR及測序方法比較,兩種方法檢測HBV血清型的結(jié)果差異不顯著。4.我國HBV血清型及基因型的初步探討收集HBV血清樣本,通過建立的HBV血清型檢測方法及PCR測序法,成功分析了這些樣本的血清型及基因型。在408例HBV陽性樣本中,adr血清型330例,adw血清型50例,ayr和ayw血清型各14例;B基因型116例,C基因型255例,D基因型37例,未發(fā)現(xiàn)A、E、F、G、H等基因型。不同血清型、基因型的性別分布沒有顯著差異。另外,不同血清型、基因型患者的年齡段分布沒有顯著差異。HBV基因組DNA(HBVDNA)水平、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)水平以及HBeAg陽性率在各血清型以及基因型中差異顯著。adr血清型中HBVDNA、ALT水平最高,其次是adw及ayr,最低的是ayw;HBeAg陽性率adw最高,其次是adr及ayw,最低為ayr。C基因型HBV DNA、ALT水平以及HBeAg陽性率最高,D基因型HBV DNA、ALT水平高于B基因型,B基因型HBeAg陽性率多于D基因型。HBV血清型與基因型在我國的分布有顯著差異。Adr為我國主要血清型,在全國范圍內(nèi)均有所分布;adw血清型主要集中于南方地區(qū);ayr及ayw主要分布在新疆地區(qū)�；蛐虲是我國的優(yōu)勢基因型,在各個地區(qū)均有分布;B基因型集中分布于華東、華中及華南地區(qū);基因型D則主要出現(xiàn)在新疆地區(qū)。本研究建立的雙抗體夾心ELISAHBV血清型檢測方法準(zhǔn)確、簡便,而且,我們對來自中國大范圍地區(qū)的HBV感染者樣本同時進(jìn)行血清型與基因型的檢測,結(jié)果相對更具有代表性和真實性,更能準(zhǔn)確地反應(yīng)我國HBV感染者基因型及血清型的地理分布特征。這為研究病毒變異、探討HBV發(fā)病機(jī)制和流行病學(xué)提供了有力工具。
【圖文】：

ＨＢＶ主要以三種形式存在。第一種是圓球狀顆粒，直徑４２邋ｍｎ，是具有感染性的完逡逑整的ＨＢＶ。此種病毒在１９６５年由丹娜發(fā)現(xiàn)，所以又被稱為丹娜顆粒（Ｄａｎｅ顆粒）。逡逑Ｄａｎｅ顆粒包括外殼和核心兩個部分（如圖１－２）。夕卜殼厚７－８邋ｎｍ，由脂質(zhì)雙層和蛋白質(zhì)逡逑組成。脂質(zhì)雙層內(nèi)有前Ｓ１蛋白、前Ｓ２蛋白和Ｓ蛋白，它們又構(gòu)成了外殼大、中、小三逡逑種蛋白形式，統(tǒng)稱為ＨＢｓＡｇ。核心顆粒直徑２８邋ｎｍ，是呈二十面體立體對稱的結(jié)構(gòu)，它逡逑的表面是病毒真正的衣殼，稱為ＨＢｃＡｇ，由１８３個氨基酸組成。Ｄａｎｅ顆粒的中心部位逡逑則是部分雙鏈和單鏈的環(huán)狀ＤＮＡ和依附在上面的ＤＮＡ聚合酶。第二種顆粒為小圓球逡逑顆粒，直徑２２邋ｎｍ，是ＨＢｓＡｇ的主要組分，在血清中大量存在。這類顆粒是屬于ＨＢＶ逡逑多余的衣殼蛋白，沒有傳染性，但可以刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，所以具有中和病毒的逡逑作用，并可用于制備乙肝疫苗。ＨＢＶ第三種為管狀顆粒，直徑與第二種顆粒相同，長逡逑度為５０－２３０邋ｎｍ，均屬于ＨＢｓＡｇ，也是ＨＢＶ多余的衣殼蛋白，同樣也無傳染性［１８

ｍＲＮＡｓ逡逑＾翁逡逑ＡＡＡ＾邐—＊＾逡逑ＨＢｘｍＲＮＡ逡逑圖１－１邋ＨＢＶ基因組［１７］逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｏｆ邋ＨＢＶ逡逑ＨＢＶ主要以三種形式存在。第一種是圓球狀顆粒，直徑４２邋ｍｎ，，是具有感染性的完逡逑整的ＨＢＶ。此種病毒在１９６５年由丹娜發(fā)現(xiàn)，所以又被稱為丹娜顆粒（Ｄａｎｅ顆粒）。逡逑Ｄａｎｅ顆粒包括外殼和核心兩個部分（如圖１－２）。夕卜殼厚７－８邋ｎｍ，由脂質(zhì)雙層和蛋白質(zhì)逡逑組成。脂質(zhì)雙層內(nèi)有前Ｓ１蛋白、前Ｓ２蛋白和Ｓ蛋白，它們又構(gòu)成了外殼大、中、小三逡逑種蛋白形式，統(tǒng)稱為ＨＢｓＡｇ。核心顆粒直徑２８邋ｎｍ，是呈二十面體立體對稱的結(jié)構(gòu)，它逡逑的表面是病毒真正的衣殼，稱為ＨＢｃＡｇ，由１８３個氨基酸組成。Ｄａｎｅ顆粒的中心部位逡逑則是部分雙鏈和單鏈的環(huán)狀ＤＮＡ和依附在上面的ＤＮＡ聚合酶。第二種顆粒為小圓球逡逑顆粒，直徑２２邋ｎｍ，是ＨＢｓＡｇ的主要組分，在血清中大量存在。這類顆粒是屬于ＨＢＶ逡逑多余的衣殼蛋白
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R512.62;R181.3

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本文編號：2620070