【摘要】： Fgl2纖維介素基因(fibrinogen-like protein 2/fibroleukin)又名fgl2凝血酶原酶基因,簡(jiǎn)稱fgl2基因,屬纖維蛋白原相關(guān)蛋白超家族,主要由活化的巨噬細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生。Fgl2有兩種表型,跨膜型和分泌型�？缒ば蚮gl2主要的生物學(xué)活性類似于活化的凝血因子Xa,可直接催化凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?繼而使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白,從而快速啟動(dòng)凝血途徑。已有的研究表明fgl2與重型肝炎、自發(fā)性流產(chǎn)、同種及異種移植排斥反應(yīng)等疾病的病情進(jìn)展有密切關(guān)系。在MHV-3病毒感染的敏感小鼠體內(nèi),鼠纖維介素基因(mfgl2)高度表達(dá),已證實(shí)MHV-3病毒的核心蛋白可以激活mfgl2的高度表達(dá),且這種高度表達(dá)是通過(guò)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子HNF-4與mfgl2基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域的順式作用元件位點(diǎn)結(jié)合導(dǎo)致了該基因的激活。 在亞洲,乙型肝炎病毒(HBV)是引起人類重型肝炎的主要病因之一。HBV編碼蛋白已被證實(shí)具有激活人體內(nèi)多種基因的功能。以往研究表明,Fgl2基因的高度表達(dá)與鼠暴發(fā)性肝炎以及人類重型肝炎的發(fā)病有密切關(guān)系。為探討HBV編碼蛋白是否對(duì)人纖維介素基因(hfgl2)具有激活作用及其相關(guān)分子機(jī)制,我們進(jìn)行了以下試驗(yàn)。首先,為研究HBV編碼蛋白是否對(duì)hfgl2基因具有激活作用以及何種病毒蛋白發(fā)揮激活hfgl2基因的作用,我們構(gòu)建了HBV編碼蛋白HBc、HBs和HBx的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HBc、pcDNA-HBs和pcDNA-HBx,將其分別與hfgl2啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒及β半乳糖苷酶基因表達(dá)質(zhì)粒(β-Gal)共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞和HepG2細(xì)胞,采用免疫組織化學(xué)和免疫印記方法(Western blotting)鑒定病毒蛋白的表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因熒光素酶(LUC)及β半乳糖苷酶的表達(dá)活性,反映病毒蛋白對(duì)hfgl2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染了HBV病毒蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞均能瞬時(shí)表達(dá)相應(yīng)的HBV編碼蛋白。相對(duì)熒光素酶的結(jié)果提示:在CHO細(xì)胞,轉(zhuǎn)染pcDNA-HBc組和pcDNA-HBx組相對(duì)熒光素酶的活性是對(duì)照組(即轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1組)的5.4和6倍,在HepG2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染pcDNA-HBc組和pcDNA-HBx組相對(duì)熒光素酶的活性是對(duì)照組的8.7和11倍,表明HBc蛋白和HBx蛋白均具有激活hfgl2的功能,而HBs蛋白則不能激活。 為研究HBV編碼蛋白作用下參與hfgl2基因激活作用的轉(zhuǎn)錄因子及順式作用元件,我們構(gòu)建了一系列5’端缺失而保留共同3’端的hfgl2基因啟動(dòng)子蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,將其分別與HBV編碼蛋白HBc、和HBx的真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染試驗(yàn),即系列啟動(dòng)子缺失試驗(yàn),結(jié)果表明:在hfgl2基因啟動(dòng)子-712位至-568位(相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn))之間存在著激活該基因的調(diào)控序列。采用生物信息學(xué)方法分析,在hfgl2基因啟動(dòng)子的-712位至-568位之間存在著五個(gè)主要的候選轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),采用Quick-Change定點(diǎn)突變方法,將其突變形成hfgl2基因啟動(dòng)子突變質(zhì)粒,經(jīng)測(cè)序證實(shí)五個(gè)位點(diǎn)均突變成功。將hfgl2基因啟動(dòng)子突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在HBc作用下,重疊位點(diǎn)LEF-1/c-Ets-2的相對(duì)熒光素酶活性降低66%,而在HBx作用下,重疊位點(diǎn)LEF-1/c-Ets-2和HSTF的相對(duì)熒光素酶活性降低70%和60%,其他位點(diǎn)相對(duì)熒光素酶活性沒有明顯改變。凝膠遷移試驗(yàn)(EMSA)表明在病毒蛋白作用下,轉(zhuǎn)錄因子c-Ets-2能與hfgl2基因啟動(dòng)子上相關(guān)順式作用元件結(jié)合從而激活該基因的表達(dá),染色質(zhì)免疫沉淀試驗(yàn)(ChiP)表明,與轉(zhuǎn)錄因子c-Ets-2結(jié)合的DNA位于hfgl2基因啟動(dòng)子部位,進(jìn)一步證實(shí)c-Ets-2是激活該基因的必須的轉(zhuǎn)錄因子。共聚焦顯微鏡檢測(cè)c-Ets-2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),顯示轉(zhuǎn)染病毒蛋白HBc和HBx真核表達(dá)質(zhì)粒后,在胞核及胞漿中均可見c-Ets-2基因的表達(dá),其表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組)以及轉(zhuǎn)染HBs真核表達(dá)質(zhì)粒組均明顯增強(qiáng),且有核轉(zhuǎn)移的發(fā)生。Western blotting試驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)染病毒蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HBc組和pcDNA-HBx組,胞核內(nèi)c-Ets-2的表達(dá)較對(duì)照組明顯增強(qiáng),進(jìn)一步說(shuō)明了轉(zhuǎn)錄因子在病毒蛋白作用下有移位至核內(nèi)的現(xiàn)象。采用RNA干擾的方法干預(yù)HepG2細(xì)胞中c-Ets-2的表達(dá),結(jié)果顯示,與未干預(yù)組相比,采用c-Ets-2 shRNA干擾質(zhì)粒組hfgl2基因啟動(dòng)子熒光素酶的活性降低了64.8%,而采用無(wú)關(guān)序列的shRNA干擾質(zhì)粒組熒光素酶的活性無(wú)明顯改變,表明在病毒蛋白HBc和HBx作用下,轉(zhuǎn)錄因子c-Ets-2對(duì)激活hfgl2基因起重要作用。 對(duì)于人類重型肝炎患者,采用共聚焦顯微鏡、Western blotting以及流式細(xì)胞儀等方法發(fā)現(xiàn)其外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中c-Ets-2的表達(dá)較健康對(duì)照者明顯增強(qiáng)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究表明,重型肝炎患者的P-JNK、P-p38 MAPK以及P-ERK的磷酸化水平較健康對(duì)照者明顯增強(qiáng),提示重型肝炎患者JNK、p38 MAPK以及ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活。體外實(shí)驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)染了病毒蛋白HBc真核表達(dá)質(zhì)粒的THP-1細(xì)胞其轉(zhuǎn)錄因子c-Ets-2的表達(dá)均明顯高于未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞,且c-Ets-2的表達(dá)能被ERK途徑阻斷劑PD098059所特異性阻斷,提示在HBc作用下,c-Ets-2的表達(dá)依賴于ERK途徑的激活。轉(zhuǎn)染了病毒蛋白HBx真核表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞其轉(zhuǎn)錄因子c-Ets-2的表達(dá)均明顯高于未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞,且c-Ets-2的表達(dá)能被JNK途徑阻斷劑SP600125所特異性阻斷,提示在HBx作用下,c-Ets-2的表達(dá)依賴于JNK途徑的激活。 以上結(jié)果說(shuō)明,乙型肝炎病毒蛋白HBc及HBx分別通過(guò)激活JNK途徑及ERK途徑,繼而激活轉(zhuǎn)錄因子c-Ets-2,使之移位至核內(nèi),并與hfgl2基因啟動(dòng)子上順式作用元件結(jié)合上調(diào)了hfgl2基因的表達(dá)。本研究從病毒蛋白與宿主基因的相互作用角度進(jìn)一步闡明了乙型重型肝炎hfgl2基因高度表達(dá)的分子機(jī)制,而c-Ets-2有可能成為此疾病干預(yù)的又一分子靶點(diǎn)。
【圖文】：

A B圖 1 HBs、HBc 和 HBx 基因 PCR 產(chǎn)物凝膠電泳圖A 1：HBs 基因 PCR；2：HBc 基因 PCRB 1，，2 ：HBx 基因 PCR 2 重組質(zhì)粒 pcDNA-HBs, pcDNA-HBc and pcDNA-HBx 的酶切鑒定

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與PCR2.1連接，用Hind III 和Xho I 雙酶切，所得小片段與預(yù)期相符，將PCR2.1載體上的C基因，S基因和X基因分別亞克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，酶切片段的大小均與預(yù)期相符, 見圖2。將所構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HBc、pcDNA -HBs 和 pcDNA-HBx 送上海博亞公司測(cè)序，結(jié)果與 GeneBank 上的序列（AB112066）大體一致。18
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R512.62

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 原彤彤;hFgl2凝血酶原酶蛋白的表達(dá)與慢性重型肝炎、慢性乙型肝炎及肝癌的關(guān)系[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2618999