【摘要】：目的:探索CREBH在代謝應激細胞模型和NASH小鼠模型中的作用。方法:1.通過不同濃度的H2O2、LPS分別刺激人肝癌細胞系Hep G2誘導肝細胞發(fā)生代謝應激,用PA干預小鼠肝細胞系AML-12誘導肝細胞發(fā)生脂肪變,采用Western Blot和q RT-PCR的方法檢測CREBH在代謝應激細胞模型中的表達水平。2.采用q RT-PCR和Western Blot的方法檢測CREBH在MCD飲食誘導的NASH模型中的表達水平。3.通過尾靜脈注射過表達CREBH的AAV8載體的方法,上調小鼠體內CREBH的表達量,再分別給予MCS/MCD和NCD/FFC兩種飲食方案誘導小鼠NASH模型,在特定時間點收集肝組織標本,采用HE染色、ORO染色和天狼星紅染色觀察上調CREBH對飲食誘導的NASH模型小鼠肝組織損傷的影響。結果:1.在H2O2誘導肝細胞發(fā)生氧化應激時,N-CREBH隨著H2O2干預濃度的增加而激活;采用LPS刺激肝細胞發(fā)生炎性損傷時,N-CREBH出現(xiàn)低水平活化,但活化水平與干預濃度不成正比;在PA誘導肝細胞發(fā)生脂肪變的體外模型中,我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的PA干預AML-12可顯著激活N-CREBH。綜上提示H2O2、LPS和PA等代謝應激信號均可激活CREBH,使N-CREBH表達明顯增加。2.我們通過MCD飲食成功建立了NASH小鼠模型。與MCS飲食對照組相比,CREBH m RNA的表達量在MCD 4W、6W和8W組均顯著下調,且在模型組中其表達量呈逐漸下降的趨勢。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn):與MCS飲食對照組相比,F-CREBH和N-CREBH蛋白的表達量在MCD 4W、6W和8W模型組中均顯著下調。3.在MCD飲食誘導的小鼠NASH模型中,MCD+AAV8 Crebh組與MCD+AAV8Vector相比,肝細胞脂肪變、炎性細胞浸潤和紅色膠原纖維明顯減少,提示上調CREBH可顯著改善MCD飲食誘導的NASH肝組織損傷;同時,我們通過FFC飲食建立了小鼠NAFLD向NASH進展的模型,該模型肝細胞脂肪變較MCD模型明顯,但炎癥細胞浸潤和纖維化反應輕于MCD模型。在FFC飲食誘導的小鼠NASH模型中,FFC+AAV8 Crebh組與FFC+AAV8 Vector相比,肝細胞脂肪變性、炎性細胞浸潤和膠原纖維沉積顯著減輕,提示上調CREBH可顯著改善FFC飲食誘導的NASH肝組織損傷。結論:代謝應激分子可顯著激活CREBH的表達,提示CREBH在肝細胞炎性應激性模型中發(fā)揮潛在的保護作用;在MCD和FFC兩種飲食誘導的小鼠NASH模型中,過表達CREBH可顯著改善NASH小鼠肝組織損傷。目的:探索上調CREBH改善飲食誘導的NASH模型小鼠肝組織損傷的潛在機制。方法:1.尾靜脈注射過表達CREBH的AAV8病毒載體后,給予MCD飲食誘導NASH模型,于4W、6W、8W時分批處理老鼠,收集肝組織標本和血清進行分子生物學檢測。采用生化試劑盒檢測各組小鼠肝組織內TG、TC的含量,以及血清ALT和AST的差異。采用ELISA方法檢測各組小鼠血清中炎癥因子MCP1、IL-1β和TNFα的表達水平。采用免疫組化法對各組小鼠肝組織石蠟切片進行F4/80,CD68和MPO染色,對比各組肝組織內Kuffer細胞和中性粒細胞的浸潤情況。2.在各組小鼠肝組織標本中,采用q RT-PCR法篩選CREBH可能調節(jié)的脂質代謝關鍵分子和炎癥因子。采用Western blot驗證篩選出來的脂質分子SCD1、SREBP-2和炎癥相關分子IL-1β、MCP1和IL-6的表達水平。3.通過慢病毒過表達CREBH感染小鼠AML-12細胞系,構建穩(wěn)定轉染的CREBH細胞,采用報告基因熒光素酶檢測和染色質免疫共沉淀等分子生物學的方法,研究CREBH是否能夠在基因水平上轉錄調控SCD1或MCP1的表達。結果:1.在持續(xù)8W的MCD飲食干預下,與MCS對照組相比,肝組織內TG、TC的含量在MCD模型組中組顯著上調。AAV8 Crebh組小鼠肝組織內TG、TC的含量與AAV8 Vector對照組相比顯著下調,血清ALT、AST也顯著下調。ELISA結果表明AAV8 Crebh組小鼠血清中MCP1,TNFα和IL-1β的含量與AAV8 Vector對照組相比出現(xiàn)顯著下降。肝組織切片免疫組化染色發(fā)現(xiàn),與MCD+AAV8 Vector對照組相比,MCD+AAV8 Crebh過表達組肝組織內Kuffer細胞、中性粒細胞顯著減少。2.在MCD飲食(4W、6W和8W)的干預下,與AAV8 Vector對照組相比,SCD1、PPARα和CPT1a的m RNA在AAV8 Crebh組顯著上調,SREBP-2 m RNA在AAV8 Crebh組顯著下調;同時,MCP1、IL-6和IL-1β的m RNA水平在AAV8 Crebh組均較對照AAV8 Vector組顯著下調,而Tnfα在4W時的MCD+AAV8 Crebh組未出現(xiàn)顯著下調,COX2 m RNA和HO-1 m RNA則與AAV8 Crebh的干預未出現(xiàn)顯著的相關性。進一步的蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn):在持續(xù)8W的MCD飲食干預下,與AAV8 Vector對照組相比,SCD1蛋白表達量在AAV8 Crebh組顯著上調,MCP1顯著下調。SCD1和MCP1在m RNA和蛋白水平均與CREBH的上調呈現(xiàn)顯著的相關性。3.通過報告基因熒光素酶檢測和Ch IP發(fā)現(xiàn),CREBH能與脂代謝基因SCD1和炎癥因子MCP1的基因啟動子片段結合,而過表達CREBH后,SCD1的啟動子報告基因熒光素酶活性顯著上調,而MCP1的啟動子報告基因熒光素酶活性則顯著下調。結論:CREBH通過基因水平轉錄激活去飽和酶SCD1的啟動子,使SCD1在m RNA和蛋白水平表達均顯著增加,并通過直接轉錄抑制炎癥因子MCP1的啟動子,改善NASH小鼠的肝組織炎癥損傷。
【圖文】：

圖 1：不同干預情況下 CREBH 的表達與活化水平中，A 為 HepG2 的實驗結果；B 和 C 為 AML-12 的實驗結果。**p < 0.01度分別為 0、125、250、500 μM 的 H2O2干預 HepG2 細胞，于干預后 16進行 F-CREBH、N-CREBH 和 p-IRE1（內質網應激的標記）蛋白質檢測10、20、40 μg/ml 的 LPS 干預 HepG2 細胞，于干預 16 h 后收集細胞進測。用 0、200、400、600 和 800 μM 的 PA 干預 AML-12 細胞，于干預 24 h 進行 CREBH mRNA 的檢測。用 0、200、400、600 和 800 μM 的 PA 干預 AML-12 細胞，于干預 24 h 進行 F-CREBH 和 N-CREBH 蛋白水平的檢測。ASH 小鼠模型的建立及 CREBH 在 NASH 小鼠模型肝組織中的表達情況2.1 為了明確 CREBH 在肝臟炎癥損傷中的作用及其機制，我們采用 MC

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文肝組織 HE 染色，我們發(fā)現(xiàn)在 MCS 對照小鼠肝組織中，未見明顯異常改CD 飲食分別干預小鼠 4W、6W 與 8W 后，小鼠肝組織出現(xiàn)明顯的大泡性脂區(qū)和小葉內大量炎性細胞浸潤和肝細胞氣球樣變，隨著造模時間的延長，變逐漸加重，8W 時，，模型組肝組織內可見炎性細胞呈灶狀聚集，表明我 飲食成功建立了小鼠 NASH 模型。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R575.1

【參考文獻】

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1 Veronika Zámbó;Laura Simon-Szabó;Péter Szelényi;va Kereszturi;Gábor Bánhegyi;Miklós Csala;;Lipotoxicity in the liver[J];World Journal of Hepatology;2013年10期

2 Yoshihisa Takahashi;Yurie Soejima;Toshio Fukusato;;Animal models of nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis[J];World Journal of Gastroenterology;2012年19期

本文編號：2617271