【摘要】：目的:探索CREBH在代謝應(yīng)激細(xì)胞模型和NASH小鼠模型中的作用。方法:1.通過不同濃度的H2O2、LPS分別刺激人肝癌細(xì)胞系Hep G2誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生代謝應(yīng)激,用PA干預(yù)小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML-12誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變,采用Western Blot和q RT-PCR的方法檢測CREBH在代謝應(yīng)激細(xì)胞模型中的表達(dá)水平。2.采用q RT-PCR和Western Blot的方法檢測CREBH在MCD飲食誘導(dǎo)的NASH模型中的表達(dá)水平。3.通過尾靜脈注射過表達(dá)CREBH的AAV8載體的方法,上調(diào)小鼠體內(nèi)CREBH的表達(dá)量,再分別給予MCS/MCD和NCD/FFC兩種飲食方案誘導(dǎo)小鼠NASH模型,在特定時間點(diǎn)收集肝組織標(biāo)本,采用HE染色、ORO染色和天狼星紅染色觀察上調(diào)CREBH對飲食誘導(dǎo)的NASH模型小鼠肝組織損傷的影響。結(jié)果:1.在H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時,N-CREBH隨著H2O2干預(yù)濃度的增加而激活;采用LPS刺激肝細(xì)胞發(fā)生炎性損傷時,N-CREBH出現(xiàn)低水平活化,但活化水平與干預(yù)濃度不成正比;在PA誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變的體外模型中,我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的PA干預(yù)AML-12可顯著激活N-CREBH。綜上提示H2O2、LPS和PA等代謝應(yīng)激信號均可激活CREBH,使N-CREBH表達(dá)明顯增加。2.我們通過MCD飲食成功建立了NASH小鼠模型。與MCS飲食對照組相比,CREBH m RNA的表達(dá)量在MCD 4W、6W和8W組均顯著下調(diào),且在模型組中其表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn):與MCS飲食對照組相比,F-CREBH和N-CREBH蛋白的表達(dá)量在MCD 4W、6W和8W模型組中均顯著下調(diào)。3.在MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH模型中,MCD+AAV8 Crebh組與MCD+AAV8Vector相比,肝細(xì)胞脂肪變、炎性細(xì)胞浸潤和紅色膠原纖維明顯減少,提示上調(diào)CREBH可顯著改善MCD飲食誘導(dǎo)的NASH肝組織損傷;同時,我們通過FFC飲食建立了小鼠NAFLD向NASH進(jìn)展的模型,該模型肝細(xì)胞脂肪變較MCD模型明顯,但炎癥細(xì)胞浸潤和纖維化反應(yīng)輕于MCD模型。在FFC飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH模型中,FFC+AAV8 Crebh組與FFC+AAV8 Vector相比,肝細(xì)胞脂肪變性、炎性細(xì)胞浸潤和膠原纖維沉積顯著減輕,提示上調(diào)CREBH可顯著改善FFC飲食誘導(dǎo)的NASH肝組織損傷。結(jié)論:代謝應(yīng)激分子可顯著激活CREBH的表達(dá),提示CREBH在肝細(xì)胞炎性應(yīng)激性模型中發(fā)揮潛在的保護(hù)作用;在MCD和FFC兩種飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH模型中,過表達(dá)CREBH可顯著改善NASH小鼠肝組織損傷。目的:探索上調(diào)CREBH改善飲食誘導(dǎo)的NASH模型小鼠肝組織損傷的潛在機(jī)制。方法:1.尾靜脈注射過表達(dá)CREBH的AAV8病毒載體后,給予MCD飲食誘導(dǎo)NASH模型,于4W、6W、8W時分批處理老鼠,收集肝組織標(biāo)本和血清進(jìn)行分子生物學(xué)檢測。采用生化試劑盒檢測各組小鼠肝組織內(nèi)TG、TC的含量,以及血清ALT和AST的差異。采用ELISA方法檢測各組小鼠血清中炎癥因子MCP1、IL-1β和TNFα的表達(dá)水平。采用免疫組化法對各組小鼠肝組織石蠟切片進(jìn)行F4/80,CD68和MPO染色,對比各組肝組織內(nèi)Kuffer細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤情況。2.在各組小鼠肝組織標(biāo)本中,采用q RT-PCR法篩選CREBH可能調(diào)節(jié)的脂質(zhì)代謝關(guān)鍵分子和炎癥因子。采用Western blot驗證篩選出來的脂質(zhì)分子SCD1、SREBP-2和炎癥相關(guān)分子IL-1β、MCP1和IL-6的表達(dá)水平。3.通過慢病毒過表達(dá)CREBH感染小鼠AML-12細(xì)胞系,構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CREBH細(xì)胞,采用報告基因熒光素酶檢測和染色質(zhì)免疫共沉淀等分子生物學(xué)的方法,研究CREBH是否能夠在基因水平上轉(zhuǎn)錄調(diào)控SCD1或MCP1的表達(dá)。結(jié)果:1.在持續(xù)8W的MCD飲食干預(yù)下,與MCS對照組相比,肝組織內(nèi)TG、TC的含量在MCD模型組中組顯著上調(diào)。AAV8 Crebh組小鼠肝組織內(nèi)TG、TC的含量與AAV8 Vector對照組相比顯著下調(diào),血清ALT、AST也顯著下調(diào)。ELISA結(jié)果表明AAV8 Crebh組小鼠血清中MCP1,TNFα和IL-1β的含量與AAV8 Vector對照組相比出現(xiàn)顯著下降。肝組織切片免疫組化染色發(fā)現(xiàn),與MCD+AAV8 Vector對照組相比,MCD+AAV8 Crebh過表達(dá)組肝組織內(nèi)Kuffer細(xì)胞、中性粒細(xì)胞顯著減少。2.在MCD飲食(4W、6W和8W)的干預(yù)下,與AAV8 Vector對照組相比,SCD1、PPARα和CPT1a的m RNA在AAV8 Crebh組顯著上調(diào),SREBP-2 m RNA在AAV8 Crebh組顯著下調(diào);同時,MCP1、IL-6和IL-1β的m RNA水平在AAV8 Crebh組均較對照AAV8 Vector組顯著下調(diào),而Tnfα在4W時的MCD+AAV8 Crebh組未出現(xiàn)顯著下調(diào),COX2 m RNA和HO-1 m RNA則與AAV8 Crebh的干預(yù)未出現(xiàn)顯著的相關(guān)性。進(jìn)一步的蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn):在持續(xù)8W的MCD飲食干預(yù)下,與AAV8 Vector對照組相比,SCD1蛋白表達(dá)量在AAV8 Crebh組顯著上調(diào),MCP1顯著下調(diào)。SCD1和MCP1在m RNA和蛋白水平均與CREBH的上調(diào)呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性。3.通過報告基因熒光素酶檢測和Ch IP發(fā)現(xiàn),CREBH能與脂代謝基因SCD1和炎癥因子MCP1的基因啟動子片段結(jié)合,而過表達(dá)CREBH后,SCD1的啟動子報告基因熒光素酶活性顯著上調(diào),而MCP1的啟動子報告基因熒光素酶活性則顯著下調(diào)。結(jié)論:CREBH通過基因水平轉(zhuǎn)錄激活去飽和酶SCD1的啟動子,使SCD1在m RNA和蛋白水平表達(dá)均顯著增加,并通過直接轉(zhuǎn)錄抑制炎癥因子MCP1的啟動子,改善NASH小鼠的肝組織炎癥損傷。
【圖文】：

圖 1：不同干預(yù)情況下 CREBH 的表達(dá)與活化水平中，A 為 HepG2 的實驗結(jié)果；B 和 C 為 AML-12 的實驗結(jié)果。**p < 0.01度分別為 0、125、250、500 μM 的 H2O2干預(yù) HepG2 細(xì)胞，于干預(yù)后 16進(jìn)行 F-CREBH、N-CREBH 和 p-IRE1（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)記）蛋白質(zhì)檢測10、20、40 μg/ml 的 LPS 干預(yù) HepG2 細(xì)胞，于干預(yù) 16 h 后收集細(xì)胞進(jìn)測。用 0、200、400、600 和 800 μM 的 PA 干預(yù) AML-12 細(xì)胞，于干預(yù) 24 h 進(jìn)行 CREBH mRNA 的檢測。用 0、200、400、600 和 800 μM 的 PA 干預(yù) AML-12 細(xì)胞，于干預(yù) 24 h 進(jìn)行 F-CREBH 和 N-CREBH 蛋白水平的檢測。ASH 小鼠模型的建立及 CREBH 在 NASH 小鼠模型肝組織中的表達(dá)情況2.1 為了明確 CREBH 在肝臟炎癥損傷中的作用及其機(jī)制，我們采用 MC

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文肝組織 HE 染色，我們發(fā)現(xiàn)在 MCS 對照小鼠肝組織中，未見明顯異常改CD 飲食分別干預(yù)小鼠 4W、6W 與 8W 后，小鼠肝組織出現(xiàn)明顯的大泡性脂區(qū)和小葉內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞氣球樣變，隨著造模時間的延長，變逐漸加重，8W 時，，模型組肝組織內(nèi)可見炎性細(xì)胞呈灶狀聚集，表明我 飲食成功建立了小鼠 NASH 模型。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R575.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 Veronika Zámbó;Laura Simon-Szabó;Péter Szelényi;va Kereszturi;Gábor Bánhegyi;Miklós Csala;;Lipotoxicity in the liver[J];World Journal of Hepatology;2013年10期

2 Yoshihisa Takahashi;Yurie Soejima;Toshio Fukusato;;Animal models of nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis[J];World Journal of Gastroenterology;2012年19期

本文編號：2617271