【摘要】：目的:肝星狀細(xì)胞活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制,其活化過程中發(fā)生的表型改變已獲得認(rèn)識,但是導(dǎo)致這一系列表型改變的精細(xì)機(jī)制仍知之甚少。本課題組前期已證實(shí)缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hif-1)通過調(diào)節(jié)自噬影響肝星狀細(xì)胞的活化,通過全基因組表達(dá)芯片分析缺氧誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)基因的表達(dá),篩選到與自噬相關(guān)的Bnip3(Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3)蛋白。在此基礎(chǔ)上開展本課題,旨在探討核轉(zhuǎn)錄因子Hif-1靶基因Bnip3調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化和自噬的可能機(jī)制,以進(jìn)一步揭示肝纖維化發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制,尋找逆轉(zhuǎn)肝纖維化的靶點(diǎn)。方法:采用氯化鈷(CoCl_2)化學(xué)誘導(dǎo)缺氧法刺激人肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞,qPCR和Western blot檢測LX-2細(xì)胞中Bnip3的表達(dá);以日本血吸蟲感染小鼠為肝纖維化動物模型,用免疫組織化學(xué)染色法檢測小鼠肝臟組織中Bnip3的表達(dá);對LX-2進(jìn)行缺氧處理,Western blot檢測P62、α-SMA以及LC3B表達(dá),免疫熒光染色技術(shù)檢測P62,觀察LX-2細(xì)胞自噬;用Hif-1抑制劑YC-1抑制Hif-1的表達(dá),缺氧或LPS刺激LX-2細(xì)胞,用Western blot和免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡檢測Bnip3表達(dá);用特異性siRNA干擾Bnip3表達(dá),用Western blot檢測LX2在缺氧或LPS刺激下α-SMA、LC3B表達(dá);膠原酶消化-Percoll分離法分離BALB/c小鼠的原代肝星狀細(xì)胞,用Western blot檢測原代肝星狀細(xì)胞自然活化過程中Hif-1、Bnip3和自噬相關(guān)分子LC3B和P62以及活化相關(guān)分子α-SMA的表達(dá),用免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡檢測GFAP、Bnip3及P62的表達(dá);在原代肝星狀細(xì)胞體外自然活化過程中加入Hif-1抑制劑YC-1,Western blot和免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡檢測Bnip3的表達(dá),用特異性siRNA干擾Bnip3表達(dá),Western blot檢測原代肝星狀細(xì)胞自然活化過程中α-SMA和LC3B表達(dá)。結(jié)果:缺氧處理的人肝星狀細(xì)胞LX-2和血吸蟲肝纖維化小鼠肝臟組織中Bnip3分子表達(dá)升高;LX-2缺氧處理后發(fā)生自噬;抑制LX-2細(xì)胞中Hif-1α表達(dá)可減少Bnip3的表達(dá);干擾LX-2細(xì)胞中Bnip3表達(dá)可阻抑LX-2細(xì)胞自噬發(fā)生并抑制細(xì)胞活化;小鼠原代肝星狀細(xì)胞在體外自然活化過程中Bnip3表達(dá)升高;原代肝星狀細(xì)胞自然活化過程中發(fā)生自噬且Hif-1α表達(dá)升高;抑制原代肝星狀細(xì)胞中Hif-1α表達(dá),Bnip3表達(dá)不再升高;干擾原代肝星狀細(xì)胞中Bnip3表達(dá),影響肝星狀細(xì)胞活化和自噬發(fā)生。結(jié)論:Hif-1通過靶分子Bnip3調(diào)控的肝星狀細(xì)胞活化和自噬。
【圖文】：

圖 2. LX-2 人肝星狀細(xì)胞缺氧處理后發(fā)生自噬。（A-B）LX-2 細(xì)胞用 CoCl2誘導(dǎo)缺氧，分別收集 0h 和 8h的細(xì)胞總蛋白, Western blot 檢測自噬相關(guān)蛋白 P62 和 LC3B 的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)用不同批次樣品重復(fù) 3 次，結(jié)果用 Mean ±SD 表示。**：P< 0.01。（C）將部分 LX-2 細(xì)胞接種于放置了無菌蓋玻片的六孔板中，給予LX-2 細(xì)胞 CoCl2處理，免疫熒光染色檢測自噬相關(guān)分子 P62 的表達(dá)，在熒光顯微鏡下拍攝（200×，紅色：P62，Alexa Fluor 555 Conjugate；藍(lán)色：DAPI）。3．抑制 LX-2 細(xì)胞中 Hif-1α 表達(dá)可減少 Bnip3 的表達(dá)為了探究 Hif-1 與 Bnip3 在 LX-2 細(xì)胞中的關(guān)系，用 Hif-1 抑制劑 YC-1 抑制 LX-2 中 Hif-1 表達(dá)，缺氧刺激 8h，Western blot 檢測 Bnip3 和 Hif-1 蛋白的表達(dá)，Bnip3 的表達(dá)隨 Hif-1 的抑制而減少。為了擴(kuò)大本研究的意義，我們還利用炎癥因子脂多糖 LPS 刺激細(xì)胞，Western blot 結(jié)果同樣提示，抑制 Hif-1 表達(dá)則導(dǎo)致 Bnip3 表達(dá)降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 3A 和圖 3B)；Hif-1 對 Bnip3 的調(diào)控在細(xì)胞學(xué)水平也予以證實(shí)，YC-1預(yù)處理的LX-2細(xì)胞在缺氧或LPS刺激8h后，免疫熒光染色法檢測Bnip3的表達(dá)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到Bnip3在CoCl2

圖 3.抑制 LX-2 細(xì)胞中 Hif-1α 表達(dá)可減少 Bnip3 的表達(dá)。（A-B）LX-2 在 Hif-1 抑制劑 YC-1 的處理下，給予細(xì)胞 100umol CoCl2或 2ug/ml LPS 刺激，在 0h、1h 和 8h 收集細(xì)胞內(nèi)總蛋白，Western blot 檢測 Hif-1、Bnip3 的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)用不同批次樣品重復(fù) 3 次，結(jié)果用 Mean ±SD 表示，*：P< 0.05，**：P< 0.01，，***：P< 0.001。 （C）在六孔板中放入無菌的蓋玻片，接種 LX-2，在 Hif-1 抑制劑 YC-1 的處理下，給予細(xì)胞100umol CoCl2或 2ug/ml LPS 刺激，免疫熒光染色檢測 Bnip3 的表達(dá)，在激光共聚焦顯微鏡下拍攝（400×，紅色：P62，Alexa Fluor 555 Conjugate；藍(lán)色：DAPI）。4．干擾 LX-2 細(xì)胞中 Bnip3 表達(dá)可阻抑 LX-2 細(xì)胞自噬發(fā)生并抑制細(xì)胞活化。我們進(jìn)一步使用特異性 siRNA 干擾 Bnip3 在 LX-2 細(xì)胞中的表達(dá)，觀察 LX-2細(xì)胞中 Bnip3 的表達(dá)降低是否對細(xì)胞的自噬和活化有影響。使用 50nM siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 18h 后，用 CoCl2或 LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞 8h，Western blot 檢測到，Bnip3 被特異性 siRNA 抑制表達(dá)后，CoCl2或 LPS 誘導(dǎo)的自噬標(biāo)記分子 LC3B 不再增多；肝星狀細(xì)胞活化相關(guān)分子 -SMA 的表達(dá)也有明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 4A和 4B）。上述結(jié)果說明 Hif-1 靶分子 Bnip3 調(diào)控 LX-2 細(xì)胞的活化和自噬。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575.2

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本文編號：2617113