發(fā)布時(shí)間：2020-04-06 23:02

【摘要】：目的:肝星狀細(xì)胞活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制,其活化過(guò)程中發(fā)生的表型改變已獲得認(rèn)識(shí),但是導(dǎo)致這一系列表型改變的精細(xì)機(jī)制仍知之甚少。本課題組前期已證實(shí)缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hif-1)通過(guò)調(diào)節(jié)自噬影響肝星狀細(xì)胞的活化,通過(guò)全基因組表達(dá)芯片分析缺氧誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)基因的表達(dá),篩選到與自噬相關(guān)的Bnip3(Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3)蛋白。在此基礎(chǔ)上開(kāi)展本課題,旨在探討核轉(zhuǎn)錄因子Hif-1靶基因Bnip3調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化和自噬的可能機(jī)制,以進(jìn)一步揭示肝纖維化發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制,尋找逆轉(zhuǎn)肝纖維化的靶點(diǎn)。方法:采用氯化鈷(CoCl_2)化學(xué)誘導(dǎo)缺氧法刺激人肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞,qPCR和Western blot檢測(cè)LX-2細(xì)胞中Bnip3的表達(dá);以日本血吸蟲(chóng)感染小鼠為肝纖維化動(dòng)物模型,用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)小鼠肝臟組織中Bnip3的表達(dá);對(duì)LX-2進(jìn)行缺氧處理,Western blot檢測(cè)P62、α-SMA以及LC3B表達(dá),免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)P62,觀察LX-2細(xì)胞自噬;用Hif-1抑制劑YC-1抑制Hif-1的表達(dá),缺氧或LPS刺激LX-2細(xì)胞,用Western blot和免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)Bnip3表達(dá);用特異性siRNA干擾Bnip3表達(dá),用Western blot檢測(cè)LX2在缺氧或LPS刺激下α-SMA、LC3B表達(dá);膠原酶消化-Percoll分離法分離BALB/c小鼠的原代肝星狀細(xì)胞,用Western blot檢測(cè)原代肝星狀細(xì)胞自然活化過(guò)程中Hif-1、Bnip3和自噬相關(guān)分子LC3B和P62以及活化相關(guān)分子α-SMA的表達(dá),用免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)GFAP、Bnip3及P62的表達(dá);在原代肝星狀細(xì)胞體外自然活化過(guò)程中加入Hif-1抑制劑YC-1,Western blot和免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)Bnip3的表達(dá),用特異性siRNA干擾Bnip3表達(dá),Western blot檢測(cè)原代肝星狀細(xì)胞自然活化過(guò)程中α-SMA和LC3B表達(dá)。結(jié)果:缺氧處理的人肝星狀細(xì)胞LX-2和血吸蟲(chóng)肝纖維化小鼠肝臟組織中Bnip3分子表達(dá)升高;LX-2缺氧處理后發(fā)生自噬;抑制LX-2細(xì)胞中Hif-1α表達(dá)可減少Bnip3的表達(dá);干擾LX-2細(xì)胞中Bnip3表達(dá)可阻抑LX-2細(xì)胞自噬發(fā)生并抑制細(xì)胞活化;小鼠原代肝星狀細(xì)胞在體外自然活化過(guò)程中Bnip3表達(dá)升高;原代肝星狀細(xì)胞自然活化過(guò)程中發(fā)生自噬且Hif-1α表達(dá)升高;抑制原代肝星狀細(xì)胞中Hif-1α表達(dá),Bnip3表達(dá)不再升高;干擾原代肝星狀細(xì)胞中Bnip3表達(dá),影響肝星狀細(xì)胞活化和自噬發(fā)生。結(jié)論:Hif-1通過(guò)靶分子Bnip3調(diào)控的肝星狀細(xì)胞活化和自噬。
【圖文】：

圖 2. LX-2 人肝星狀細(xì)胞缺氧處理后發(fā)生自噬。（A-B）LX-2 細(xì)胞用 CoCl2誘導(dǎo)缺氧，分別收集 0h 和 8h的細(xì)胞總蛋白, Western blot 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白 P62 和 LC3B 的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)用不同批次樣品重復(fù) 3 次，結(jié)果用 Mean ±SD 表示。**：P< 0.01。（C）將部分 LX-2 細(xì)胞接種于放置了無(wú)菌蓋玻片的六孔板中，給予LX-2 細(xì)胞 CoCl2處理，免疫熒光染色檢測(cè)自噬相關(guān)分子 P62 的表達(dá)，在熒光顯微鏡下拍攝（200×，紅色：P62，Alexa Fluor 555 Conjugate；藍(lán)色：DAPI）。3．抑制 LX-2 細(xì)胞中 Hif-1α 表達(dá)可減少 Bnip3 的表達(dá)為了探究 Hif-1 與 Bnip3 在 LX-2 細(xì)胞中的關(guān)系，用 Hif-1 抑制劑 YC-1 抑制 LX-2 中 Hif-1 表達(dá)，缺氧刺激 8h，Western blot 檢測(cè) Bnip3 和 Hif-1 蛋白的表達(dá)，Bnip3 的表達(dá)隨 Hif-1 的抑制而減少。為了擴(kuò)大本研究的意義，我們還利用炎癥因子脂多糖 LPS 刺激細(xì)胞，Western blot 結(jié)果同樣提示，抑制 Hif-1 表達(dá)則導(dǎo)致 Bnip3 表達(dá)降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 3A 和圖 3B)；Hif-1 對(duì) Bnip3 的調(diào)控在細(xì)胞學(xué)水平也予以證實(shí)，YC-1預(yù)處理的LX-2細(xì)胞在缺氧或LPS刺激8h后，免疫熒光染色法檢測(cè)Bnip3的表達(dá)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到Bnip3在CoCl2

圖 3.抑制 LX-2 細(xì)胞中 Hif-1α 表達(dá)可減少 Bnip3 的表達(dá)。（A-B）LX-2 在 Hif-1 抑制劑 YC-1 的處理下，給予細(xì)胞 100umol CoCl2或 2ug/ml LPS 刺激，在 0h、1h 和 8h 收集細(xì)胞內(nèi)總蛋白，Western blot 檢測(cè) Hif-1、Bnip3 的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)用不同批次樣品重復(fù) 3 次，結(jié)果用 Mean ±SD 表示，*：P< 0.05，**：P< 0.01，，***：P< 0.001。 （C）在六孔板中放入無(wú)菌的蓋玻片，接種 LX-2，在 Hif-1 抑制劑 YC-1 的處理下，給予細(xì)胞100umol CoCl2或 2ug/ml LPS 刺激，免疫熒光染色檢測(cè) Bnip3 的表達(dá)，在激光共聚焦顯微鏡下拍攝（400×，紅色：P62，Alexa Fluor 555 Conjugate；藍(lán)色：DAPI）。4．干擾 LX-2 細(xì)胞中 Bnip3 表達(dá)可阻抑 LX-2 細(xì)胞自噬發(fā)生并抑制細(xì)胞活化。我們進(jìn)一步使用特異性 siRNA 干擾 Bnip3 在 LX-2 細(xì)胞中的表達(dá)，觀察 LX-2細(xì)胞中 Bnip3 的表達(dá)降低是否對(duì)細(xì)胞的自噬和活化有影響。使用 50nM siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 18h 后，用 CoCl2或 LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞 8h，Western blot 檢測(cè)到，Bnip3 被特異性 siRNA 抑制表達(dá)后，CoCl2或 LPS 誘導(dǎo)的自噬標(biāo)記分子 LC3B 不再增多；肝星狀細(xì)胞活化相關(guān)分子 -SMA 的表達(dá)也有明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 4A和 4B）。上述結(jié)果說(shuō)明 Hif-1 靶分子 Bnip3 調(diào)控 LX-2 細(xì)胞的活化和自噬。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R575.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 高冀蓉;;脂肪肝的類型[J];家庭醫(yī)學(xué);2016年11期

2 展玉濤,魏紅山,李定國(guó);肝星狀細(xì)胞活化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[J];臨床肝膽病雜志;2000年03期

3 展玉濤;肝星狀細(xì)胞活化的功能改變[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(消化系疾病分冊(cè));1999年01期

4 左雁;陳文玲;胡嚴(yán)勻;石安華;王憲東;陳文慧;;細(xì)胞自噬、肝星狀細(xì)胞活化與肝纖維化的關(guān)系[J];山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2016年06期

5 羅雨欣;張曉嵐;;肝星狀細(xì)胞活化、增殖的免疫調(diào)控機(jī)制研究[J];臨床薈萃;2017年03期

6 郭圓圓;樊圓圓;張永婷;王瑜;王媛慧;蔡潔;李軍;章莉莉;;間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清抑制星狀細(xì)胞活化治療肝纖維化的研究[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2017年09期

7 蔡曉波;范建高;田麗艷;錢燕;;高血糖對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞活化及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響[J];肝臟;2006年02期

8 潘勤,陸良勇,李定國(guó),尤漢寧,徐芹芳;生長(zhǎng)抑素受體與肝星狀細(xì)胞活化的相關(guān)性研究[J];中華消化雜志;2004年06期

9 潘傳芳,劉成海;瘦素促進(jìn)大鼠肝星狀細(xì)胞活化及其細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶磷酸化[J];中華消化雜志;2005年08期

10 鄧欣,朱清靜,聶廣,楊大國(guó),吳其愷,劉成海;剔毒護(hù)肝方對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的調(diào)控作用(摘要)[J];中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志;2000年S1期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 楊愛(ài)婷;胡豆豆;賈繼東;王寶恩;尤紅;;鐵調(diào)素可以降低肝星狀細(xì)胞活化并提高抗氧化應(yīng)激水平:鐵調(diào)素可以作為一個(gè)新的抗纖維化藥物[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十六次全國(guó)病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2013年

2 劉成海;劉平;胡義揚(yáng);朱大元;;丹酚酸B鹽對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1刺激肝星狀細(xì)胞活化與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[A];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)第十四次全國(guó)消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2002年

3 張永生;劉清君;屠玨;朱飛葉;付玲珠;王華;;細(xì)胞傳感器在肝星狀細(xì)胞活化檢測(cè)中的應(yīng)用[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì)第二十五屆全國(guó)脾胃病學(xué)術(shù)交流會(huì)論文匯編[C];2013年

4 饒慧瑛;魏來(lái);費(fèi)然;孫焱;王江華;;干擾素-β對(duì)肝星狀細(xì)胞活化調(diào)控機(jī)制的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十二次全國(guó)病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

5 鄧欣;朱清靜;聶廣;楊大國(guó);吳其愷;劉成海;;剔毒護(hù)肝方對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的調(diào)控作用(摘要)[A];第九次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2000年

6 蔡曉波;范建高;田麗艷;錢燕;;高血糖對(duì)四氯化碳模型大鼠肝臟星狀細(xì)胞活化及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響[A];第五屆全國(guó)肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

7 潘傳芳;劉成海;;瘦素對(duì)肝星狀細(xì)胞活化及其EKR活性的影響[A];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)第十六次全國(guó)消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2004年

8 李善高;呂賓;孟立娜;蔡利軍;劉軍;胡華軍;;MEF2A與肝星狀細(xì)胞活化的關(guān)系研究[A];第二屆浙江省消化病學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2009年

9 張玉;易龍;張乾勇;糜漫天;;二氫楊梅素對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的影響及機(jī)制研究[A];2017中國(guó)營(yíng)養(yǎng)醫(yī)學(xué)發(fā)展論壇暨全軍營(yíng)養(yǎng)醫(yī)學(xué)大會(huì)論文匯編[C];2017年

10 高月求;李曼;孫學(xué)華;周振華;朱曉駿;吳惠春;;MAPK、PI3K/AKT信號(hào)通路在纖維化蛋白誘導(dǎo)人肝星狀細(xì)胞活化中的作用[A];全國(guó)第6屆中西醫(yī)結(jié)合傳染病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2015年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前5條

1 鐘立;Hedgehog信號(hào)通路參與LXRβ調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化的機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2019年

2 任龍飛;鎘暴露影響肝星狀細(xì)胞活化及其氧化應(yīng)激機(jī)制研究[D];蘭州大學(xué);2019年

3 潘若浪;間充質(zhì)干細(xì)胞抗肝臟纖維化作用及其機(jī)制的探索研究[D];浙江大學(xué);2011年

4 何嘉怡;SATB1在肝星狀細(xì)胞活化和大鼠肝纖維化形成中作用機(jī)制的研究[D];華中科技大學(xué);2015年

5 段妍君;參杖顆粒調(diào)控Rho/Rho激酶途徑對(duì)肝星狀細(xì)胞活化影響的研究[D];湖北中醫(yī)藥大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉潔;Hif-1靶基因Bnip3在肝星狀細(xì)胞活化中調(diào)控自噬機(jī)制的研究[D];華中科技大學(xué);2019年

2 李明明;miR-340通過(guò)靶定SPP1抑制肝星狀細(xì)胞活化[D];華北理工大學(xué);2019年

3 楊瓊;Nucleophosmin在肝星狀細(xì)胞活化中的作用及其機(jī)制研究[D];廈門大學(xué);2017年

4 許紫薇;二氫楊梅素通過(guò)鐵自噬途徑抑制鐵過(guò)載誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化[D];南華大學(xué);2018年

5 王曉航;胰島星狀細(xì)胞活化的關(guān)鍵基因篩選及其鑒定[D];東南大學(xué);2018年

6 潘春曉;酸敏感離子通道1a對(duì)PDGF誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化的影響及其可能機(jī)制[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2014年

7 焦黎;纖溶酶原激活物抑制因子-1對(duì)肝星狀細(xì)胞活化及其細(xì)胞外基質(zhì)的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

8 汪長(zhǎng)發(fā);Akt抑制肝星狀細(xì)胞活化的實(shí)驗(yàn)性研究[D];中南大學(xué);2007年

9 段小鵬;神經(jīng)纖毛蛋白-1 siRNA對(duì)PDGF-BB刺激肝星狀細(xì)胞活化、增殖及遷移的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

10 黃思敏;姜黃素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞活化相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響[D];暨南大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2617113