【摘要】：潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種病因不明的腸道炎癥性疾病，是我國(guó)炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的主要臨床形式之一。IBD患者常伴發(fā)一些腸外表現(xiàn)(extraintestinal manifestations, EIMs)，肝膽病變是IBD常見(jiàn)的EIMs。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝膽病變是影響IBD病死率的重要因素之一。因此，研究IBD發(fā)病中相關(guān)的肝膽病變及其機(jī)制，對(duì)IBD的綜合治療具有重要意義。 眾所周知，正常機(jī)體腸腔內(nèi)含有大量細(xì)菌及內(nèi)毒素，而IBD發(fā)病時(shí)因受損結(jié)腸黏膜的通透性升高，引起細(xì)菌和內(nèi)毒素移位，繼而導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥。內(nèi)毒素的本質(zhì)是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上的脂多糖(1ipopolysaccharide, LPS)成分，細(xì)菌裂解或粘附在其他細(xì)胞上時(shí)LPS釋放出來(lái)。肝臟是清除腸源性細(xì)菌及內(nèi)毒素的重要場(chǎng)所，越來(lái)越多的證據(jù)表明，LPS/Toll樣受體4(Toll like receptor4, TLR4)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種慢性肝病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。 TLR是天然免疫系統(tǒng)中識(shí)別病原微生物的主要受體，其中，TLR4在人體的固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用。TLR4是將LPS信號(hào)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的表面受體，LPS是肝臟巨噬細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞, KC)強(qiáng)的激活劑，KC被LPS激活后可以啟動(dòng)LPS/TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)以及白介素-17A(interleukin-17A, IL-17A)等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而引起肝膽病變。 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的干細(xì)胞，可通過(guò)增強(qiáng)腸道上皮修復(fù)能力、減輕腸道炎癥反應(yīng)治療IBD，對(duì)多種原因引起的肝損傷也具有顯著緩解作用。鑒于上述機(jī)制，我們推斷MSCs對(duì)IBD相關(guān)肝膽病變也有治療作用。為此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)人臍帶來(lái)源的MSCs(human umbilical cord MSCs, hUC-MSCs)移植治療慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎相關(guān)肝膽病變的作用及可能機(jī)制進(jìn)行了初步研究。 目的：觀察MSCs對(duì)慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜炎癥及相關(guān)肝膽病變的治療作用與機(jī)制。 方法：①慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型通過(guò)飲用2%右旋葡聚糖硫酸鈉(Dextran sodium sulfate, DSS)成功建立，1～5天、8～12天、15～19天、22～26天、29～33天和36～40天飲用2%的DSS，41、42天及其它時(shí)間飲用蒸餾水。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、DSS+Vehicle組、DSS+MSCs組，每組10只；DSS+MSCs組在造模第14天時(shí)經(jīng)尾靜脈注射1×10~6/200μL的hUC-MSCs，正常對(duì)照組與DSS+Vehicle組則給予等體積PBS作為對(duì)照。第43天處死動(dòng)物。②結(jié)腸黏膜炎癥改變的評(píng)估包括每天體重(Bodyweight, BW)改變、疾病活動(dòng)指數(shù)(Disease activity index, DAI)、結(jié)腸長(zhǎng)度等指標(biāo)以及結(jié)腸大體形態(tài)學(xué)改變和組織病理學(xué)評(píng)分。③采用Haematoxylineosin staining(HE染色)、Masson’s trichrome staining(MT染色)方法觀察肝臟病理學(xué)改變。④自動(dòng)生化儀檢測(cè)小鼠肝功能改變。⑤偶氮基質(zhì)顯色法檢測(cè)血清中LPS含量。⑥對(duì)各組動(dòng)物腸系膜淋巴結(jié)(Mesenteric lymphnodes, MLN)勻漿液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)以明確有無(wú)大腸桿菌感染。⑦采用免疫組織化學(xué)染色、western blot和real-time Q-PCR方法檢測(cè)各組小鼠肝臟組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、TLR4、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor-associated factor6, TRAF6)和核因子-κB(nuclear factorkappa B, NF-κB)蛋白及mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：①與正常對(duì)照組相比，DSS+Vehicle組動(dòng)物體重明顯減輕，經(jīng)MSCs治療后，DSS+MSCs組動(dòng)物體重較DSS+Vehicle組明顯回升；與正常對(duì)照組相比，DSS+Vehicle組動(dòng)物DAI增加(4.00±0.65vs0.00±0.00,P0.05)，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短(3.93cm±0.22cm vs6.30cm±0.55cm,P0.05)，結(jié)腸壁充血、水腫明顯(2.75±0.50vs0.00±0.00, P0.05)，，結(jié)腸組織病理切片顯示淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞明顯浸潤(rùn)，可見(jiàn)多灶性淺潰瘍，病理評(píng)分顯著增加(11.80±0.96vs0.00±0.00, P0.05)；而經(jīng)過(guò)MSCs移植治療后，DSS+MSCs組DAI較DSS+Vehicle組明顯降低(0.30±0.46vs3.05±0.25, P0.05)，同時(shí)結(jié)腸長(zhǎng)度有所增長(zhǎng)(5.18cm±0.73cm vs3.93cm±0.22cm, P0.05)，結(jié)腸壁充血、水腫明顯減輕(1.11±0.45vs2.75±0.50,P0.05)，結(jié)腸組織病理切片結(jié)果顯示淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，病理評(píng)分顯著降低(5.0±0.62vs11.8±0.96, P0.05)。②肝臟組織HE和MT染色結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，DSS+Vehicle組可見(jiàn)肝內(nèi)匯管區(qū)膽管和膽管周圍淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞明顯浸潤(rùn)，肝細(xì)胞排列散亂，細(xì)胞水腫、胞漿疏松化，同時(shí)肝小葉匯管區(qū)內(nèi)仍有少量纖維組織生成，有短的纖維間隔伸入肝小葉，未見(jiàn)纖維組織異常改變，病理評(píng)分顯著增加(4.70±0.62vs0.00±0.00, P0.05)，而經(jīng)過(guò)MSCs治療后，DSS+MSCs組淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，肝細(xì)胞變性損傷明顯減輕，病理評(píng)分降低顯著(2.56±0.40vs4.70±0.62, P0.05)。③血清肝功能檢測(cè)顯示，同正常對(duì)照組相比，DSS+Vehicle組小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase, ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平明顯升高(ALT:56.82U/L±10.40U/L vs34.50U/L±8.23U/L,P0.05; AST:104.25U/L±17.26U/L vs78.00U/L±10.40U/L, P0.05)，白蛋白(albumin, ALB)水平明顯降低(30.33U/L±1.21U/L vs38.60U/L±1.18U/L.P0.05)，血清總膽紅素(total bilirubin, TBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin,DBIL)水平升高不明顯(TBIL:3.08μmol/L±0.57μmol/L vs2.49μmol/L±0.55μmol/L, P0.05; DBIL:1.47μmol/L±0.27μmol/L vs1.05μmol/L±0.36μmol/L, P0.05)；而給予MSCs治療后，同DSS+Vehicle組相比，ALT、AST水平顯著降低(ALT:46.00U/L±8.70U/L vs56.82U/L±10.40U/L,P0.05; AST:87.94U/L±13.51U/L vs104.25U/L±17.26U/L, P0.05)，ALB水平顯著升高(35.43U/L±2.43U/L vs30.33U/L±1.21U/L, P0.05)，TBIL、DBIL水平降低不明顯(TBIL:2.99μmol/L±0.70μmol/L vs3.08μmol/L±0.57μmol/L, P0.05; DBIL:1.24μmol/L±0.18μmol/L vs1.47μmol/L±0.27μmol/L, P0.05)。④與正常對(duì)照組相比，DSS+Vehicle組小鼠血清中LPS水平顯著增加(0.19EU/mL±0.03EU/mL vs0.11EU/mL±0.01EU/mL, P0.05)；而DSS+MSCs組小鼠血清中LPS水平較DSS+Vehicle組明顯降低(0.15EU/mL±0.01EU/mL vs0.19EU/mL±0.03EU/mL,P0.05)。⑤正常對(duì)照組小鼠MLN勻漿液中無(wú)細(xì)菌移位(0%)，與正常對(duì)照組相比，DSS+Vehicle組小鼠細(xì)菌移位率明顯增加(90%)，而DSS+MSCs組MLN細(xì)菌移位率較DSS+Vehicle組明顯降低(15%)。⑥免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果顯示：DSS+Vehicle組小鼠肝臟組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、TLR4、TRAF6和NF-κB蛋白表達(dá)水平，較正常對(duì)照組顯著增加(TNF-α:0.79±0.07vs0.20±0.02, P0.05; IFN-γ:0.82±0.08vs0.15±0.01,P0.05; IL-1β:0.75±0.08vs0.10±0.01, P0.05; IL-17A:0.66±0.07vs0.12±0.01, P0.05; TLR4:0.72±0.08vs0.15±0.02, P0.05; TRAF6:0.61±0.06vs0.10±0.01, P0.05; NF-κB:0.67±0.08vs0.13±0.02, P0.05)，而DSS+MSCs組TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、TLR4、TRAF6和NF-κB蛋白表達(dá)水平較DSS+Vehicle組明顯下降(TNF-α:0.27±0.03vs0.79±0.08,P0.05; IFN-γ:0.41±0.05vs0.82±0.08, P0.05; IL-1β:0.35±0.04vs0.75±0.08, P0.05; IL-17A:0.35±0.04vs0.66±0.07, P0.05; TLR4:0.38±0.04vs0.72±0.08, P0.05; TRAF6:0.29±0.03vs0.61±0.06, P0.05;NF-κB:0.33±0.04vs0.67±0.08, P0.05)。⑦Western blot和real-time Q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，DSS+Vehicle組小鼠肝臟組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、TLR4、TRAF6和NF-κB蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯增加(蛋白:1.50±0.13vs1.05±0.05,1.86±0.10vs1.30±0.06,1.79±0.14vs1.11±0.07,1.51±0.07vs1.01±0.05,2.10±0.26vs1.48±0.17,1.77±0.18vs1.13±0.11,1.86±0.10vs1.42±0.09, P0.05; mRNA:1.94±0.14vs1.00±0.00,2.11±0.23vs1.00±0.00,2.03±0.19vs1.00±0.00,1.91±0.16vs1.00±0.00,2.46±0.23vs1.00±0.00,1.63±0.20vs1.00±0.00,1.84±0.13vs1.00±0.00, P0.05)；而DSS+MSCs組與DSS+Vehicle組小鼠比較肝臟組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-17A、TLR4、TRAF6和NF-κB蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯下降(蛋白:1.24±0.09vs1.50±0.13,1.43±0.15vs1.86±0.10,1.27±0.13vs1.79±0.14,1.28±0.07vs1.51±0.07,1.40±0.13vs2.10±0.26,1.36±0.15vs1.77±0.18,1.59±0.09vs1.86±0.10, P0.05; mRNA:1.39±0.17vs1.94±0.14,1.72±0.20vs2.11±0.23,1.33±0.17vs2.03±0.19,1.56±0.15vs1.91±0.16,1.61±0.17vs2.46±0.23,1.46±0.11vs1.63±0.20,1.49±0.19vs1.84±0.13, P0.05)。 結(jié)論：MSCs可減輕慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜炎癥及相關(guān)肝膽病變；其機(jī)制可能與MSCs能降低腸黏膜通透性、促進(jìn)腸黏膜的修復(fù)、減少腸源性內(nèi)毒素血癥，從而下調(diào)LPS與TLR4介導(dǎo)的肝膽損傷有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R574.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2616893