發(fā)布時間：2020-04-06 15:41

【摘要】： 肝纖維化(hepatic fibrosis)是各種慢性肝臟疾病導(dǎo)致的細胞外間質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分過多合成及異常沉積，是各種慢性肝損傷共同的病理變化，有很高的發(fā)病率和死亡率。肝纖維化的主要病因包括病毒性肝炎、酒精中毒以及膽道梗阻等。肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）在肝纖維化的形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。正常情況下，HSCs主要儲存維生素A，并發(fā)生少量增殖，合成少量膠原。然而，肝損傷后，HSCs內(nèi)維生素A消失并轉(zhuǎn)化成肌成纖維樣細胞，即活化的HSCs，表達α 平滑肌肌動蛋白（α smooth muscle actin，α SMA）并且合成各種ECM成分。 活化的HSCs不僅是ECM的主要來源，還表達參與ECM降解的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）及其抑制因子(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs)。諸多細胞因子和生長因子可以影響HSCs活化，調(diào)節(jié)MMPs及TIMPs的分泌。然而，最近發(fā)現(xiàn)細胞-ECM間的相互作用與這些因子一樣，可以調(diào)節(jié)HSCs分泌MMPs和TIMPs。整合素（integrin）是廣泛存在于細胞表面的跨膜糖蛋白，是ECM成分的主要受體，是細胞內(nèi)外信息交流的橋梁，因此，整合素可能介導(dǎo)了ECM對MMPs和TIMPs分泌的調(diào)節(jié)。 ECM與整合素結(jié)合首先引起粘著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)分子聚集在粘著斑（focal adhesion plaque，F(xiàn)AP）處，使FAK N-端區(qū)的酪氨酸Tyr397磷酸化而被激活。FAK激活后可能激活多條信號途徑，其中比較清楚的是RAS依賴的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）是MAPK家族中研究得最為清楚的成員，其通路RAS-RAF-MEK-ERK參與細胞多種功能活動。本研究從HSCs與ECM之間的相互作用著手，以FAK、ERK1/2為切入點，有機結(jié)合整體和離體試驗，研究整合素信號通路在 WP=5 肝纖維化及HSCs中對MMP及TIMP的影響。實驗內(nèi)容主要包括以下四部分： 第一部分：MMP-13、TIMP-1在大鼠肝纖維化形成過程中的動態(tài)表達 目的：探討實驗性大鼠肝纖維化形成過程中與ECM代謝有關(guān)的MMP-13、TIMP-1的動態(tài)表達以及TIMP-1與ECM主要成分I型膠原之間的相互關(guān)系。 方法：采用膽總管結(jié)扎(bile duct ligation，BDL)大鼠肝纖維化模型，將80只雄性Sprague Dawley大鼠隨機分成假手術(shù)組與模型組。模型組分別于結(jié)扎后2h、6h、2d、1wk、2wk、3wk、4wk麻醉動物，假手術(shù)組與4wk模型組同批麻醉。采用HE染色確定模型建立情況，，Masson三色染色測定ECM沉積情況；免疫組織化學(xué)方法研究Ⅰ型膠原在肝纖維化不同時期肝組織中的分布及含量的動態(tài)變化；RT-PCR方法研究MMP-13 mRNA在肝纖維化不同時期肝組織中的分布及含量的動態(tài)變化；原位雜交和Western blot技術(shù)分別觀察TIMP-1 mRNA及蛋白表達情況。 結(jié)果：①Masson三色染色顯示隨著肝纖維化的發(fā)展，造模1～4wk大鼠肝組織內(nèi)膠原纖維所占的面積（10.41%±1.33%，17.32%±1.53%，33.67%±2.28%，42.63%±1.68%）均顯著高于假手術(shù)組（7.35%±1.14%），P＜0.05。②隨著肝纖維化發(fā)展I型膠原在肝臟內(nèi)大量沉積，從匯管區(qū)向外延伸，并廣泛存在于纖維間隔及增生的小膽管周圍，中央靜脈周圍強陽性染色，增生的粗大的膠原纖維包繞肝細胞形成明顯的假小葉，Disse間隙內(nèi)有I型膠原沉積。造模1wk、2wk、3wk和4wk大鼠肝組織內(nèi)的I型膠原陽性面積分別為8.57±1.88%，13.51±2.93%，30.88%±3.30%，38.05±3.72%，除第1wk外,其余各組均顯著性高于對照組假手術(shù)組（5.35±1.88%），P＜0.01。即肝纖維化程度越重，I型膠原染色陽性面積所占比例越大。③MMP-13 mRNA在肝纖維化形成過程中無明顯變化。④隨著結(jié)扎時間的延長，TIMP-1 mRNA的表達呈持續(xù)上升趨勢．造模1wk、2wk、3wk和4wk大鼠肝臟組織內(nèi)TIMP-1 mRNA陽性面積分別為17.59%±1.70%，25.89%±1.93%，31.82%±1.24%，37.29%±2.65%，均顯著高于假手術(shù)組(4.77%±0.97%)，P＜0.01，與Ⅰ型膠原呈顯著正相關(guān)。⑤正常肝組 WP=6 織TIMP-1蛋白微量表達，造模6h開始上調(diào)，造模4wk TIMP-1表達最高，比假手術(shù)組增加1倍以上。 結(jié)論：肝纖維化形成過程中ECM沉積是其主要病理改變，其中Ⅰ型膠原增加最明顯；肝纖維化形成過程中主要是TIMP-1表達的變化，無論是蛋白水平還是mRNA水平，都顯著增加，MMP-13 mRNA無顯著變化。 第二部分：精-甘-天冬-絲氨酸四肽對肝星狀細胞膠原代謝的影響及機制研究 目的：探討精-甘-天冬-絲氨酸(RGDS)四肽對纖維粘連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）刺激的HSCs合成膠原、表達MMP-13以及TIMP-1的影響，為利用RGDS四肽調(diào)控HSCs膠原代謝提供實驗理論依據(jù)。 方法：應(yīng)用體外HSCs培養(yǎng)技術(shù)，采用3H-脯氨酸(3H-pro)摻入法測定HSCs膠原合成；采用甲苯胺蘭染色方法測定細胞粘附率；RT-PCR方法檢測MMP-13 mRNA水平；應(yīng)用原位雜交和Western blot技術(shù)分別檢測TIMP-1 mRNA和蛋白水平。陰性對照組采用精-甘-谷-絲氨酸（RGES）四肽。 結(jié)果：①RGDS四肽25μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1組對HSCs 3H-pro摻入結(jié)果與對照組、FN組相比，均顯著下降，P＜0.01，摻入抑制率分別是23.15%、
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2616705