【摘要】： 肝纖維化(hepatic fibrosis)是各種慢性肝臟疾病導(dǎo)致的細(xì)胞外間質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分過(guò)多合成及異常沉積，是各種慢性肝損傷共同的病理變化，有很高的發(fā)病率和死亡率。肝纖維化的主要病因包括病毒性肝炎、酒精中毒以及膽道梗阻等。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）在肝纖維化的形成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。正常情況下，HSCs主要儲(chǔ)存維生素A，并發(fā)生少量增殖，合成少量膠原。然而，肝損傷后，HSCs內(nèi)維生素A消失并轉(zhuǎn)化成肌成纖維樣細(xì)胞，即活化的HSCs，表達(dá)α 平滑肌肌動(dòng)蛋白（α smooth muscle actin，α SMA）并且合成各種ECM成分。 活化的HSCs不僅是ECM的主要來(lái)源，還表達(dá)參與ECM降解的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）及其抑制因子(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs)。諸多細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子可以影響HSCs活化，調(diào)節(jié)MMPs及TIMPs的分泌。然而，最近發(fā)現(xiàn)細(xì)胞-ECM間的相互作用與這些因子一樣，可以調(diào)節(jié)HSCs分泌MMPs和TIMPs。整合素（integrin）是廣泛存在于細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，是ECM成分的主要受體，是細(xì)胞內(nèi)外信息交流的橋梁，因此，整合素可能介導(dǎo)了ECM對(duì)MMPs和TIMPs分泌的調(diào)節(jié)。 ECM與整合素結(jié)合首先引起粘著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)分子聚集在粘著斑（focal adhesion plaque，F(xiàn)AP）處，使FAK N-端區(qū)的酪氨酸Tyr397磷酸化而被激活。FAK激活后可能激活多條信號(hào)途徑，其中比較清楚的是RAS依賴(lài)的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）是MAPK家族中研究得最為清楚的成員，其通路RAS-RAF-MEK-ERK參與細(xì)胞多種功能活動(dòng)。本研究從HSCs與ECM之間的相互作用著手，以FAK、ERK1/2為切入點(diǎn)，有機(jī)結(jié)合整體和離體試驗(yàn)，研究整合素信號(hào)通路在 WP=5 肝纖維化及HSCs中對(duì)MMP及TIMP的影響。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下四部分： 第一部分：MMP-13、TIMP-1在大鼠肝纖維化形成過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá) 目的：探討實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化形成過(guò)程中與ECM代謝有關(guān)的MMP-13、TIMP-1的動(dòng)態(tài)表達(dá)以及TIMP-1與ECM主要成分I型膠原之間的相互關(guān)系。 方法：采用膽總管結(jié)扎(bile duct ligation，BDL)大鼠肝纖維化模型，將80只雄性Sprague Dawley大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組與模型組。模型組分別于結(jié)扎后2h、6h、2d、1wk、2wk、3wk、4wk麻醉動(dòng)物，假手術(shù)組與4wk模型組同批麻醉。采用HE染色確定模型建立情況，，Masson三色染色測(cè)定ECM沉積情況；免疫組織化學(xué)方法研究Ⅰ型膠原在肝纖維化不同時(shí)期肝組織中的分布及含量的動(dòng)態(tài)變化；RT-PCR方法研究MMP-13 mRNA在肝纖維化不同時(shí)期肝組織中的分布及含量的動(dòng)態(tài)變化；原位雜交和Western blot技術(shù)分別觀察TIMP-1 mRNA及蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：①M(fèi)asson三色染色顯示隨著肝纖維化的發(fā)展，造模1～4wk大鼠肝組織內(nèi)膠原纖維所占的面積（10.41%±1.33%，17.32%±1.53%，33.67%±2.28%，42.63%±1.68%）均顯著高于假手術(shù)組（7.35%±1.14%），P＜0.05。②隨著肝纖維化發(fā)展I型膠原在肝臟內(nèi)大量沉積，從匯管區(qū)向外延伸，并廣泛存在于纖維間隔及增生的小膽管周?chē)�，中央靜脈周?chē)鷱?qiáng)陽(yáng)性染色，增生的粗大的膠原纖維包繞肝細(xì)胞形成明顯的假小葉，Disse間隙內(nèi)有I型膠原沉積。造模1wk、2wk、3wk和4wk大鼠肝組織內(nèi)的I型膠原陽(yáng)性面積分別為8.57±1.88%，13.51±2.93%，30.88%±3.30%，38.05±3.72%，除第1wk外,其余各組均顯著性高于對(duì)照組假手術(shù)組（5.35±1.88%），P＜0.01。即肝纖維化程度越重，I型膠原染色陽(yáng)性面積所占比例越大。③MMP-13 mRNA在肝纖維化形成過(guò)程中無(wú)明顯變化。④隨著結(jié)扎時(shí)間的延長(zhǎng)，TIMP-1 mRNA的表達(dá)呈持續(xù)上升趨勢(shì)．造模1wk、2wk、3wk和4wk大鼠肝臟組織內(nèi)TIMP-1 mRNA陽(yáng)性面積分別為17.59%±1.70%，25.89%±1.93%，31.82%±1.24%，37.29%±2.65%，均顯著高于假手術(shù)組(4.77%±0.97%)，P＜0.01，與Ⅰ型膠原呈顯著正相關(guān)。⑤正常肝組 WP=6 織TIMP-1蛋白微量表達(dá)，造模6h開(kāi)始上調(diào)，造模4wk TIMP-1表達(dá)最高，比假手術(shù)組增加1倍以上。 結(jié)論：肝纖維化形成過(guò)程中ECM沉積是其主要病理改變，其中Ⅰ型膠原增加最明顯；肝纖維化形成過(guò)程中主要是TIMP-1表達(dá)的變化，無(wú)論是蛋白水平還是mRNA水平，都顯著增加，MMP-13 mRNA無(wú)顯著變化。 第二部分：精-甘-天冬-絲氨酸四肽對(duì)肝星狀細(xì)胞膠原代謝的影響及機(jī)制研究 目的：探討精-甘-天冬-絲氨酸(RGDS)四肽對(duì)纖維粘連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）刺激的HSCs合成膠原、表達(dá)MMP-13以及TIMP-1的影響，為利用RGDS四肽調(diào)控HSCs膠原代謝提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。 方法：應(yīng)用體外HSCs培養(yǎng)技術(shù)，采用3H-脯氨酸(3H-pro)摻入法測(cè)定HSCs膠原合成；采用甲苯胺蘭染色方法測(cè)定細(xì)胞粘附率；RT-PCR方法檢測(cè)MMP-13 mRNA水平；應(yīng)用原位雜交和Western blot技術(shù)分別檢測(cè)TIMP-1 mRNA和蛋白水平。陰性對(duì)照組采用精-甘-谷-絲氨酸（RGES）四肽。 結(jié)果：①RGDS四肽25μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1組對(duì)HSCs 3H-pro摻入結(jié)果與對(duì)照組、FN組相比，均顯著下降，P＜0.01，摻入抑制率分別是23.15%、
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 李霞,李亮成;丹參與維拉帕米對(duì)大鼠肝纖維化、肝硬化防治作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2003年01期

2 陳向榮,陸京伯,石漢平;丹參的藥理作用研究新進(jìn)展[J];中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志;2001年01期

3 陳岳祥,李石,范列英,孔憲濤,楊純正,于寶玲;丹參單體IH764-3抗肝纖維化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;1998年08期

本文編號(hào)：2616705