【摘要】：腹瀉的發(fā)病機制早已得到廣泛討論,但其確切機制仍需要深入研究。事實上,腸上皮細胞對大量細菌及其成分已產(chǎn)生耐受性,但是微生物產(chǎn)物是如何打破這種已建立的耐受并誘發(fā)腹瀉和其它炎癥發(fā)生的仍然不很清楚。 肥大細胞位于宿主和外環(huán)境的表面如皮膚、呼吸道和腸道。肥大細胞被認為是宿主抵御細菌感染的關(guān)鍵物質(zhì)。但是,微生物產(chǎn)物誘導肥大細胞介質(zhì)釋放從而導致腹瀉的機理尚不清楚。 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是感染性腹瀉的病因之一。肽聚糖(Peptidoglycan,PGN)是幾乎所有G~+和G~-菌的細胞壁成分,具有很強的免疫活性,它能夠改變免疫細胞的功能。并可能在細菌性腹瀉中起關(guān)鍵作用。本研究的目的:1)PGN對T84細胞單層(人類腸上皮細胞系)屏障動能的影響;2)肥大細胞對T84屏障功能的影響;3)肥大細胞系對PGN吸收途徑;4)口服PGN誘發(fā)小鼠腹瀉模型的建立;5)TLR2(Toll-like receptor,TLR)和NODs(Hucleotide-binding oligomerization domain,NOD)在介導PGN誘發(fā)的腸道肥大細胞激活過程中的意義;6)肥大細胞激活在PGN誘導的腹瀉中的必要性。 實驗方法 1.細胞培養(yǎng)和T84細胞單層功能的檢測 本實驗采用T84細胞單層(T84 Monolayer)細胞。為了評估T84細胞單層轉(zhuǎn)運PGN,我們把來自金黃色葡萄球菌的純化的PGN及HRP(Horseradishperoxidase,HRP)加入到細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中。采用ELISA的方法檢測樣本中的PGN、HRP。HRP流量作為評價T84細胞單層的通透性指標。 2.人肥大細胞系HMC-1、人單核細胞系THP-1、人中腎上皮細胞系HEK293吸收和轉(zhuǎn)運PGN的檢測 T84細胞單層和HMC-1(THP-1、HEK293)共同培養(yǎng)于細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中,然后加入PGN至腸腔側(cè)中,2h后收集細胞。細胞蛋白提取后用Western-Blot的方法檢測細胞中的PGN成分。一部分細胞用冷的丙酮固定后,用抗PGN單克隆抗體及熒光標記的兔抗鼠Ⅱ抗孵育,共聚焦顯微鏡觀察。 3.組織胺分析 用ELISA試劑盒檢測MHC-1(THP-1、HEK293)、小鼠結(jié)腸粘膜肥大細胞及P815細胞(小鼠肥大細胞系)5-HT(5-羥色胺)和組織胺水平。 4.已敲除HMC-1細胞中TLR2和NOD2的表達 RNAi技術(shù)用于檢測已敲除HMC-1細胞中TLR2和NOD2的表達。siRNA轉(zhuǎn)染的效果通過RT-PCR和Western-Blot的方法檢測。 5.PGN誘發(fā)的鼠類腹瀉動物模型 用純化的PGN不同劑量溶于生理鹽水中灌胃,灌胃前用肥大細胞對抗物預處理。計算每只小鼠糞便中含水的百分比。記錄每只小鼠的小腸、大腸濕重及體重。小腸和大腸占體重的比率作為評估腸道液體的指標。 6.P815細胞TLR2、NOD1的表達 免疫細胞化學、Western-Blot方法觀察P815細胞TLR2、NOD1的表達情況。 7.免疫染色 共聚焦顯微鏡觀察造型小鼠腸粘膜肥大細胞及P815細胞TLR2、NOD(1 or 2)的表達。 8.肥大細胞重建 培養(yǎng)的肥大細胞(純度＞95%)以30,000,40,000,和50,000個細胞/只的劑量通過尾靜脈注射到肥大細胞缺如小鼠(W/Wv)體內(nèi)1月后用于重復口服PGN實驗。 統(tǒng)計學處理 采用SPSS10.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以X±SD表示,組間差異用t檢驗檢測,三組及三組以上的組間比較用方差分析,P＜0.05認為差異具有顯著性。 結(jié)果 1.把PGN加入細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)的腸腔側(cè),把T84單層的TER(Transepithelialelectric resistance,TER)和T84對HRP的通透性作為檢測屏障功能的指標。結(jié)果表明,只加PGN并不降低T84細胞單層的TER和通透性,與對照組相比沒有明顯差異。說明PGN并不直接破壞腸粘膜屏障。 2.把融合的T84細胞和HMC-1共同培養(yǎng)在細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中。在加入PGN到腸腔側(cè)2h后,培養(yǎng)基中組織胺的釋放量的增加呈劑量依賴性,電鏡結(jié)果表明肥大細胞廣泛脫顆粒。T84細胞單層的TER在PGN刺激后明顯降低,并且在肥大細胞穩(wěn)定劑預處理后明顯得到抑制。由此證實T84細胞轉(zhuǎn)運的PGN是通過激活HMC-1而完成的。 3.為了證明TLR2介導PGN在肥大細胞中的吸收,把HMC-1培養(yǎng)在含有或不含有PGN的培養(yǎng)基中2h。然后收集并處理HMC-1細胞以證明TLR2表達。數(shù)據(jù)顯示:TLR2在HMC-1細胞中的表達:0.28±0.06,在THP-1細胞中的表達:0.29±0.1,在HEK 293中沒有表達。用抗TLR2抗體預處理的細胞上述過程受到抑制。Western-Blot、免疫細胞化學的方法同樣證明TLR2參與肥大細胞吸收PGN。 4.RT-PCR結(jié)果顯示在MHC-1細胞中檢測到NOD2 mRNA(0.28±0.08),THP-1:0.27±0.06,而在HEK293細胞中沒有檢測到NOD2 mRNA。經(jīng)預處理的HMC-1細胞釋放組織胺與對照組相比明顯受到抑制。結(jié)果顯示,PGN被吸收入細胞后與NOD2捆綁在一起從而激活MHC-1。 5.用免疫細胞化學的方法在共聚焦顯微鏡下觀察HMC-1,進一步檢測PGN是否被吸收到MHC-1細胞內(nèi)。結(jié)果表明,PGN被HMC-1和THP-1細胞吸收,并且呈劑量依賴性,PGN沒有在HEK293細胞中檢測到。 6.HMC-1和T84細胞單層共同培養(yǎng)于細胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中。分別在腸腔側(cè)中加PGN和不加PGN。在基底膜側(cè)中加MHC-1和不加MHC-1。HRP流量及TER作為記錄上皮屏障功能的指標。加入PGN組HRP的流量明顯增加,TER明顯降低,并呈劑量依賴性。用siRNA預處理TLR2和NOD2能抑制PGN致T84細胞單層屏障的破壞。HRP回收率的增加及TEP的降低與HMC-1的數(shù)量呈平行關(guān)系。證實被激活的肥大細胞危及T84細胞單層的屏障功能。 7.PGN溶于生理鹽水中以不同劑量給小鼠灌胃。腹瀉的嚴重程度與PGN呈劑量依賴性。結(jié)果表明PGN能夠誘導小鼠腹瀉。用PGN處理肥大細胞缺如小鼠(W/Wv)和肥大細胞正常同系小鼠(+/+),結(jié)果+/+小鼠出現(xiàn)腹瀉而W/Wv小鼠不出現(xiàn)腹瀉。結(jié)果表明,肥大細胞在PGN誘導的腹瀉中起重要作用。 8.用電子顯微鏡檢測肥大細胞脫顆粒,丟失顆粒成分或顆粒密度降低為脫顆粒表現(xiàn)。PGN處理的小鼠腸道組織肥大細胞脫顆粒現(xiàn)象非常明顯。PGN處理的小鼠肥大細胞脫顆粒的比率明顯增加,并呈劑量依賴性。用ELISA方法檢測PGN含量,與對照組相比PGN組,5-HT和組織胺水平明顯增高。用肥大細胞穩(wěn)定劑酮替酚處理和抗體對抗TLR2和NOD1明顯抑制5-HT和組織胺的釋放及肥大細胞脫顆粒。 9.為了證明PGN誘發(fā)肥大細胞激活的途徑,我們采用免疫印跡方法評估PGN對細胞質(zhì)I_ΚB水平的影響。I_ΚB水平的降低表明核因子I_ΚB釋放及細胞核易位。用PGN處理P815細胞,Western Blot方法評估IκB-α,IκB-β磷酸化和非磷酸化表達,PGN能使IκB-α和IκB-β水平明顯降低,并且用抗-TLR2抗體和抗-NOD1抗體預處理能抑制上述過程。表明IκB-α和IκB-β參與來自于已易位于細胞核的細胞質(zhì)復合物的核因子IκB釋放。 10.小鼠經(jīng)不同劑量肥大細胞穩(wěn)定劑酮替酚預處理,然后PGN灌胃,腹瀉被預處理的酮替酚抑制,并呈酮替芬劑量依賴性。PGN灌胃引起腹瀉發(fā)生后,腹腔注射酮替酚仍能阻止腹瀉的發(fā)生。抗組織胺和抗5-HT藥物協(xié)同作用能減弱PGN誘發(fā)的腹瀉。 結(jié)論 1.PGN不直接改變?nèi)四c上皮細胞系T84細胞單層及小鼠腸上皮屏障功能; 2.PGN激活HMC-1細胞造成T84細胞單層屏障功能減退; 3.TLR2和NOD2介導HMC-1細胞對PGN的吸收; 4.TLR2和NOD1介導PGN誘發(fā)的小鼠腸道肥大細胞激活; 5.口服PGN能夠誘發(fā)小鼠腹瀉的發(fā)生; 6.腸上皮細胞經(jīng)細胞內(nèi)途徑吸收PGN; 7.肥大細胞穩(wěn)定劑能夠抑制PGN誘發(fā)的腹瀉。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R574.62

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 陳忠龍;吳小南;;腸粘膜屏障與胃腸疾病[J];海峽預防醫(yī)學雜志;2007年02期

2 陳丹英,翟中和,舒紅兵;NF-κB激活的調(diào)節(jié)機理[J];科學通報;2003年18期

3 汝小美;肥大細胞的起源和分化[J];免疫學雜志;1992年03期

4 唐深;TLR家族及其功能研究進展[J];微生物學免疫學進展;2004年02期

5 武金寶;王繼德;張亞歷;;腸黏膜屏障研究進展[J];世界華人消化雜志;2003年05期

6 何韶衡;肥大細胞在變態(tài)反應性炎癥發(fā)病機制中的核心作用[J];中國病理生理雜志;2003年11期

7 何韶衡,李萍,MarkG.Buckley,Andrew F.Walls;應用雙重免疫標記技術(shù)鑒定肥大細胞亞型[J];中華病理學雜志;2000年05期

8 ;Key role of mast cells and their major secretory products in inflammatory bowel disease[J];World Journal of Gastroenterology;2004年03期

，

本文編號：2616184