【摘要】：腸粘膜屏障損害對機體的影響主要通過二方面因素實現(xiàn)，一是腸粘膜組織和細胞結(jié)構(gòu)的破壞；二是腸道內(nèi)微生物及其代謝產(chǎn)物逸出腸外。所以，保持完整的腸粘膜結(jié)構(gòu)和維護正常的腸道微生物平衡是防治腸粘膜屏障損傷的主要措施。 正常腸道菌群能適度刺激機體免疫反應，防止?jié)撛诘闹虏∥⑸镞^度滋生，減少腸內(nèi)過多炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，抑制粘膜免疫反應的病理性激活，因此經(jīng)腸道補充益生菌有利于維持腸道微生態(tài)平衡。乳酸鏈球菌(簡稱乳鏈菌)被證實是安全和有效的益生菌(probiotics)，，已長期應用于臨床實踐。我們設(shè)想，如果能通過乳酸鏈球菌表達某些對腸粘膜細胞有保護作用的活性蛋白質(zhì)或抗炎因子，即有利于維持腸道微生態(tài)平衡，也能達到保護腸粘膜屏障的目的，有可能為防治腸粘膜損傷提供更有效的治療選擇，近年三葉因子家族(簡稱三葉肽)的研究成果為此目標提供了可能性。 三葉因子家族(Trefoil Factor Family，TFF)是哺乳動物上皮細胞表達的一種小分子蛋白質(zhì)，目前已發(fā)現(xiàn)了三種同源染色體結(jié)構(gòu)，即TFF1、TFF2和TFF3。當前的研究已證明，TFF是正常的胃腸粘膜結(jié)構(gòu)保護和損傷修復不可缺少的物質(zhì)。因此，我們采用基因工程改建乳酸鏈球菌，使其表達人TFF2(human TFF2，hTFF2)，為腸道粘膜屏障的保護尋求一種新的治療途徑。 在本研究中，我們通過基因拼接技術(shù)在體外拼裝了帶c-myc分子標簽的hTFF2融合基因(c-myc-htff2)，并將其插入pNBC1000(包含有P59啟動子和USP45信號肽以及終止子，已由本實驗室成功構(gòu)建)信號肽下游的多克隆位點(multiple cloning site，MCS)，完成了c-myc-htff2表達載體系統(tǒng)的構(gòu)建，再將表達載體系統(tǒng)連接于穿梭質(zhì)粒，通過電穿孔轉(zhuǎn)入乳酸鏈球菌1403株(LL—1403)，成
【圖文】：

分別在C一myc一h嚇F2和pBlueseript11sk(+)獲得帶BamHI和Sall粘端的克隆位點，將c一mye一h開凡通過枷優(yōu)萬了和asl，亞克隆于pBlueseript11sk(+)載體(如圖1一3所示)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞，細菌擴增后提取質(zhì)粒進行酶切反應鑒定和DNA測序。3.2.1大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備從LB平板上挑取大腸桿菌作.oc)liTopol單菌落接種于5ml液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，吸取上述菌液1X()l理l接種量轉(zhuǎn)接于10ml液體培養(yǎng)基，37Co，劇烈振搖(200一300甲m)1.5~Zh，至on朗約為.03~.04時

分別用天湯口I和刀口腳Hl/Sal耐NPTFFZ進行單、雙酶切反應，前者形成二條帶，其中一條是與目的基因片段尸，夕硬沼尸4萬一c一myc一h術(shù)一etrminaotr大小相似的條帶:后者只形成一條帶(圖1一8)，說明Sall酶切位點插入后失活，啟動子上游和終止子下游二個筋al酶切位點實現(xiàn)了成功連接，這個結(jié)果與預期的設(shè)計完全一致。M一2M(bP)450030002000nLJO﨑八八曰UUCO，一00工工J...1
【學位授予單位】：第一軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R574

【參考文獻】

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本文編號：2615309