【摘要】： 【背景及目的】 HBV感染在全世界范圍的流行都非常嚴(yán)重，尤其是在發(fā)展中國家和亞太地區(qū)，我國是HBV感染高發(fā)地區(qū)，人群攜帶率高達(dá)約10～20％。在亞洲，重型肝炎最主要是由HBV感染引起的，而在歐美國家重型肝炎主要是由酒精性肝炎和藥物性肝炎引起。重型肝炎是急驟發(fā)生廣泛性肝細(xì)胞壞死而引起重度肝功能障礙，出現(xiàn)以肝性腦病為主的肝功能衰竭癥狀之高危疾病。該病病情嚴(yán)重，發(fā)展迅猛，發(fā)病機(jī)制尚不明了，臨床缺乏上特異、有效的治療靶點和干預(yù)手段，除非實施緊急肝移植，絕大部分患者預(yù)后不良。因此探索重型肝炎肝細(xì)胞死亡機(jī)制，并開發(fā)針對其發(fā)病機(jī)制、阻斷病理衍變過程的基因治療手段正在成為該領(lǐng)域的研究熱點和發(fā)展方向。 肝細(xì)胞過度凋亡引起的肝損傷可以引起肝衰竭，并在多種肝病的發(fā)生過程中起重要作用。在生理狀態(tài)下發(fā)生的凋亡主要是清除那些損傷的和多余的細(xì)胞，凋亡小體的吞噬不伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生。而在病理狀態(tài)下，肝細(xì)胞凋亡則有可能引起炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)中性粒細(xì)胞的浸潤、肝星狀細(xì)胞活化，發(fā)生肝臟纖維化。在重型肝炎的發(fā)病過程中，F(xiàn)as與TNFα系統(tǒng)的激活會促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生。肝細(xì)胞的凋亡途徑包括胞膜上死亡受體介導(dǎo)的外部途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)部途徑，肝細(xì)胞膜上表達(dá)最廣泛的死亡受體是CD95(AP021PFas)和TNF2a受體1(CD120a)。多項研究表明，急慢性肝病中肝細(xì)胞的凋亡一般由死亡受體介導(dǎo)。肝細(xì)胞對CD120a和CD95介導(dǎo)的凋亡具有高度的敏感性。體外實驗也證實了這一點。在LPS+D-GalN誘導(dǎo)的爆發(fā)性肝衰竭模型中，LPS的毒性實際上是由于嚴(yán)重的凋亡性肝損傷和肝細(xì)胞完全破壞所引起的。然而，有關(guān)肝細(xì)胞凋亡在MHV-3誘導(dǎo)的小鼠重型肝炎肝衰竭中的重要作用還未見相關(guān)文獻(xiàn)報道，因此研究肝細(xì)胞凋亡及其調(diào)控機(jī)制對重型肝炎肝損傷發(fā)生機(jī)理的理解具有重要意義。TNFα是一種由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。TNFα對不同的細(xì)胞類型發(fā)揮各種不相同的作用，在許多重要的病理和生理過程下作為一重要的介質(zhì)存在。而且TNFα還是凋亡的重要介質(zhì)之一，TNFα的大多數(shù)生物學(xué)效應(yīng)TNFR1介導(dǎo)。TNFR1胞內(nèi)區(qū)含死亡結(jié)構(gòu)域，可引起細(xì)胞凋亡或者通過激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB使某些細(xì)胞增殖、分化，另外也可觸發(fā)信號傳導(dǎo)級聯(lián)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指特異性針對目標(biāo)基因的同源雙鏈RNA(double-strain RNA，dsRNA)的導(dǎo)入引起目的基因不表達(dá)或減效表達(dá)，具有高效、特異，快速等優(yōu)點，應(yīng)用前景廣闊。前期研究發(fā)現(xiàn)通過尾靜脈高壓注射可以使質(zhì)粒[DNA在小鼠肝臟高效表達(dá)。尾靜脈高壓注射可將大體積的裸質(zhì)粒DNA溶液經(jīng)小鼠尾靜脈快速注入，大量的質(zhì)粒溶液導(dǎo)致循環(huán)血量的急劇增加，超過心臟負(fù)荷，血液積聚在肝竇中不能回流，延長了質(zhì)粒DNA在肝竇中的停留時間，從而被肝組織細(xì)胞攝取。因此該方法可以廣泛應(yīng)用于肝臟疾病基因干預(yù)的研究。從基因水平沉默“有害”高表達(dá)的基因可以更好地闡明該基因在疾病的發(fā)生發(fā)展中重要作用，也為探索人類重型肝炎臨床治療方法提供新的思路和手段。 具體研究目的如下： 1．針對重型肝炎發(fā)病關(guān)鍵基因mTNFR1構(gòu)建siRNA干擾質(zhì)粒，在中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0)中可以明顯抑制TNFR1基因的表達(dá)。 2．研究mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒對重型肝炎小鼠體內(nèi)mTNFR1表達(dá)的抑制，改善肝細(xì)胞的凋亡情況，生化指標(biāo)以及對小鼠重型肝炎病情發(fā)展的影響。 3．針對凋亡相關(guān)基因Fas，TNFR1構(gòu)建其真核表達(dá)載體和microRNA表達(dá)載體，并研究在miRNA在細(xì)胞水平對基因表達(dá)的抑制作用。 【方法】 1．構(gòu)建mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒和非相關(guān)對照質(zhì)粒，細(xì)胞水平分別共轉(zhuǎn)染mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒和pEGFP-TNFR1，mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒和pCDNA3．0-TNFR1，并通過顯微鏡下觀察熒光，RT-PCR、western blot技術(shù)檢測mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒的體外干預(yù)效應(yīng)。 2．采用MHV-3感染Balb／cJ小鼠制造重型肝炎動物模型；通過尾靜脈高壓注射將目的基因?qū)胄∈蟾闻K，并檢測目的基因在肝臟的表達(dá)效率；mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒高壓注射后，檢測小鼠肝組織病理、血清生化學(xué)變化，，并觀察重型肝炎小鼠生存率的改變；通過Real-time PCR、免疫組化檢測mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒干預(yù)后的小鼠肝臟mTNFR1的表達(dá)情況；用TUNNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡情況的改變，并計算凋亡指數(shù)。 3．構(gòu)建人類Fas和TNFR1基因的真核表達(dá)載體及其miRNA表達(dá)載體，并將其共轉(zhuǎn)染至人293T細(xì)胞，通過Real-time PCR和western blot檢測在細(xì)胞水平對基因表達(dá)的抑制作用。 【結(jié)果】 1．成功構(gòu)建mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒和非相關(guān)對照質(zhì)粒，并鑒定無誤；分別共轉(zhuǎn)染mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒和pEGFP-TNFR1，mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒和pCDNA3．0-TNFR1至CHO細(xì)胞，鏡下可見干預(yù)后熒光明顯減弱，RT-PCR、Western blot結(jié)果證實mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒細(xì)胞水平顯著抑制mTNFRl的表達(dá)。 2．尾靜脈高壓注射可以將目的基因?qū)胄∈蟾闻K，24h重復(fù)注射可以使表達(dá)效率提高到40％。mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒高壓注射后，重型肝炎小鼠生存率從0提高到13．3％，并顯著改善肝組織病理學(xué)變化和血清學(xué)指標(biāo)；mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒高壓注射后，顯著抑制mTNFR1在重型肝炎小鼠模型體內(nèi)的表達(dá)，并顯著減少肝細(xì)胞的凋亡。 3．成功構(gòu)建人類凋亡相關(guān)基因Fas，TNFR1的真核表達(dá)載體和miRNA干擾質(zhì)粒，并鑒定無誤；Fas-miRNA和TNFR1-miRNA干擾質(zhì)粒在細(xì)胞水平顯著抑制hFas和hTNFR1的表達(dá)。 【結(jié)論】 1．本研究利用在線軟件設(shè)計合成針對小鼠TNFR1基因的RNA干擾靶序列，通過PCR將其連接于pMSCV-U6載體，并通過序列鑒定無誤。構(gòu)建成功的的mTNFR1 shRNA干擾質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染CH0細(xì)胞，體外實驗證實可以有效且特異地下調(diào)目的基因的表達(dá)。 2．建立MHV-3誘導(dǎo)的重型肝炎小鼠模型，并通過尾靜脈高壓注射技術(shù)將外源基因高效導(dǎo)入小鼠肝臟，mTNFR1 shRNA干擾質(zhì)粒通過下調(diào)小鼠肝臟TNFR1基因的表達(dá)可以顯著提高小鼠的生存時間和生存率，并且生化指標(biāo)和肝臟的炎癥均得到明顯改善。為今后重型肝炎、腫瘤、代謝性疾病等凋亡相關(guān)的疾病治療提供了一條新途徑。 3．重型肝炎的肝細(xì)胞死亡機(jī)制主要包括肝細(xì)胞的過度凋亡，因此基因治療的靶點需包含與肝細(xì)胞凋亡相關(guān)的多個關(guān)鍵基因。本研究構(gòu)建了凋亡相關(guān)基因Fas和TNFR1真核表達(dá)質(zhì)粒和microRNA干擾質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)染至人293T細(xì)胞，在體外試驗中有效且特異得下調(diào)目的基因的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R512.6

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李詠;難治性慢性乙肝患者干擾素信號途徑的初步研究[D];華中科技大學(xué);2011年

本文編號：2615269