【摘要】：目的： 構(gòu)建乙型肝炎病毒X蛋白重組質(zhì)粒PEGFP-N1-HBX,脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染入人正常肝細(xì)胞系L02細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞,觀察HBX通過核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號通路對不同肝細(xì)胞系肝細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。 方法： 1.體外培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞。 2.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將PEGFP-N1-HBX質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞,熒光倒置顯微鏡觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中EGFP報告基因的表達,Western Blot法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)HBX蛋白的表達。 3.用特異性NF-κB信號通路阻斷劑吡咯二硫代氨基甲酸酯(PDTC)阻斷NF-κB信號通路。 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后及加入PDTC前后兩細(xì)胞系的細(xì)胞周期特征與凋亡率。 5.Western Blot技術(shù)檢測NF-κB的表達變化。 結(jié)果： 1.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的L02和lepG2細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下觀察,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PEGFP-N1-HBX和空質(zhì)粒PEGFP-N1的細(xì)胞有熒光表達；未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未見熒光表達(圖1)。 2.Western blot結(jié)果可見,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-HBX質(zhì)粒的L02和HepG2細(xì)胞組有HBX蛋白表達,而其它四組空質(zhì)粒及空白對照組則檢測不到目的蛋白條帶(圖2)。 3.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：與對照組L02細(xì)胞相比,L02/HBX細(xì)胞凋亡率明顯增加,其GO/Gl期細(xì)胞比例顯著增加,S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯減少。與對照組HepG2細(xì)胞相比,HepG2/HBX細(xì)胞凋亡率顯著降低,其G0/Gl期細(xì)胞比例顯著減少,S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯增加。PDTC作用后,L02/HBX/PDTC組較L02/HBX組凋亡率及G0/Gl期細(xì)胞比例顯著增加,S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯減少,而HepG2/HBX/PDTC組較HepG2/HBX組凋亡率及G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加,S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯減少,但其凋亡率仍低于對照組HepG2細(xì)胞,差異具有顯著意義(P0.05)。 4.Western Blot結(jié)果顯示：L02/HBX細(xì)胞NF-κB表達顯著下調(diào),而HepG2/HBX細(xì)胞NF-κB表達顯著增加,L02/HBX/PDTC和HepG2/HBX/PDTC細(xì)胞NF-κB幾乎不表達。結(jié)論： 1.成功構(gòu)建穩(wěn)定表達HBX蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株L02/HBX和HepG2/HBX。 2.HBX轉(zhuǎn)染正常肝細(xì)胞L02后,可通過下調(diào)NF-κB蛋白的表達而阻滯細(xì)胞周期進程和促進細(xì)胞凋亡,而HBX轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2后,可通過增加NF-κB蛋白的表達而發(fā)揮加速細(xì)胞周期進程和抑制細(xì)胞凋亡的作用。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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1 侯全玲;唐紅;黃飛駿;;乙型肝炎病毒X蛋白與原發(fā)性肝癌[J];世界華人消化雜志;2008年01期

2 王海平,陳孝平,何松清,丁磊;調(diào)節(jié)胞內(nèi)HBX的表達對肝細(xì)胞凋亡的影響[J];中華肝臟病雜志;2003年07期

3 Nicola Fiedler;Ellen Quant;Ludger Fink;Ralph Schuster;Wolfram H Gerlich;Stephan Schaefer;;Differential effects on apoptosis induction in hepatocyte lines by stable expression of hepatitis B virus X protein[J];World Journal of Gastroenterology;2006年29期

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本文編號：2611792