【摘要】： 目前對(duì)于晚期肝病(如肝硬化等)的最佳治療方法是肝臟移植,但是由于缺少供體以及排斥反應(yīng),使其在臨床上的應(yīng)用受到限制。相比之下,干細(xì)胞移植不僅來(lái)源廣泛,創(chuàng)傷性小,而且干細(xì)胞的免疫源性低,其排斥反應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于肝臟移植。干細(xì)胞移植不但可以用于晚期肝病,也可以用于重癥肝病的治療,前景廣闊。骨髓細(xì)胞可以分化形成肝細(xì)胞的特定干細(xì)胞群,被稱之為骨髓源性肝干細(xì)胞(bone marrow derived liver stem cells BMDLSC),為肝臟疾病治療提供了新思路和新手段。盡管肝干細(xì)胞的特征性表面標(biāo)記至今沒(méi)有發(fā)現(xiàn),但Lagasse在酪氨酸小鼠研究中發(fā)現(xiàn)c-kit+Sca+Lin-細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的能力比較強(qiáng),而后唐等在放射性小鼠肝損傷修復(fù)更是進(jìn)一步指出c-kit+Lin-(CD117)是一群富含BMDLSC的骨髓干細(xì)胞群,本小組前期研究已經(jīng)證實(shí),骨髓中CD117陽(yáng)性細(xì)胞和CD184陽(yáng)性細(xì)胞都具有較強(qiáng)的肝干細(xì)胞潛能。與其它類型的骨髓干細(xì)胞類似,c-kit+Lin細(xì)胞的數(shù)量有限,難以滿足未來(lái)應(yīng)用的需要。 本實(shí)驗(yàn)利用非連續(xù)Percoll密度梯度離心對(duì)人自體骨髓進(jìn)行分離,分離后的各界面層的細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)CD117陽(yáng)性細(xì)胞和CD184陽(yáng)性細(xì)胞的比例,確定比例最高的細(xì)胞群后,從新鮮骨髓中獲取富含CD117陽(yáng)性細(xì)胞和CD184陽(yáng)性細(xì)胞的組分用于后實(shí)驗(yàn)。然后將細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增0天、7天、14天,擴(kuò)增方案采用含10%自體血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體系中和無(wú)血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體系中加入不同濃度的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(HGPF)、促血小板生長(zhǎng)素(TPO)和白細(xì)胞介素3(IL-3),分別培養(yǎng)摸索最佳培養(yǎng)基體系,經(jīng)最佳培養(yǎng)基體系培養(yǎng)后用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定擴(kuò)增細(xì)胞中CD117陽(yáng)性細(xì)胞和CD184陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量變化,用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)(c-Met RNA表達(dá)的變化�？偨Y(jié)出人自體骨髓來(lái)源肝干細(xì)胞體外擴(kuò)增后自體移植的技術(shù)方案,為將來(lái)臨床上進(jìn)行骨髓來(lái)源肝干細(xì)胞體外擴(kuò)增后自體移植治療肝臟疾病奠定基礎(chǔ)。 [材料和方法] 1、密度梯度離心結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)提取骨髓來(lái)源肝干細(xì)胞 1.1 Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀法分離骨髓細(xì)胞群 從骨科手術(shù)回收成人骨髓2-5ml,使用percoll作為分離液,分成60%(1.077g/ml)、50%(1.067 g/ml)、40%(1.056 g/ml)、30%(1.043 g/ml)四個(gè)密度費(fèi)聯(lián)系梯度,分離出4個(gè)有核細(xì)胞組分。 1.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)各個(gè)細(xì)胞組分中CD117陽(yáng)性細(xì)胞核CD184陽(yáng)性細(xì)胞比例 細(xì)胞計(jì)數(shù)后,取1×106個(gè)細(xì)胞置于1.5ml EP管中,離心調(diào)整為100μl體積,避光環(huán)境下,各管分別以PE標(biāo)記抗人CD117直接抗體和APC標(biāo)記抗人CD184直接抗體,細(xì)胞重懸至300μl上機(jī)檢測(cè),分別記錄CD117陽(yáng)性細(xì)胞核CD184陽(yáng)性細(xì)胞比例。 2、人骨髓源性肝干細(xì)胞體外擴(kuò)增方案的探討 2.1密度梯度離心結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分離富含CD117+細(xì)胞群 采集人體骨髓10-20ml,使用percoll作為分離液,分成50%(1.067 g／ml)、40%(1.056 g／ml)兩種濃度,過(guò)濾除菌后,由下至上按密度遞減置于離心管中,將預(yù)處理后的骨髓細(xì)胞懸液緩慢加至分層液上,400g離心力,離心25～30分鐘,可見(jiàn)各密度層間細(xì)胞層,留取CD117+細(xì)胞比例最高(Percoll濃度為50%與40%之間的細(xì)胞層)的細(xì)胞層為目的細(xì)胞群。 2.2體外擴(kuò)增富含CD117+人自體骨髓來(lái)源肝干細(xì)胞 2.2.1確定細(xì)胞培養(yǎng)密度 骨髓細(xì)胞懸液,經(jīng)密度梯度離心后,留取Percoll濃度為50%與40%之間層的細(xì)胞群,分別調(diào)整細(xì)胞濃度至6.25×105／ml、1.25×106／ml、2.50×106／ml、5.00×106／ml、1.00×107／ml、2.00×107／ml五組細(xì)胞濃度,于24孔板上培養(yǎng)14天,,培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(高糖,含10%自體血清,2mg/ml注射用鹽酸頭孢甲肟),分別細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。 2.2.2確定細(xì)胞擴(kuò)增最佳體系 培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(高糖,2mg／ml注射用鹽酸頭孢甲肟),分別添加注射用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、800μg/ml),注射用促血小板生長(zhǎng)素(25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml),白細(xì)胞介素3(5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml),自體血清(10%、0%),共計(jì)128種組合。骨髓細(xì)胞懸液經(jīng)密度梯度離心后,留取Percoll濃度為50%與40%之間層的細(xì)胞群,于24孔板上,隨機(jī)分成138份按確定的最佳細(xì)胞密度(細(xì)胞濃度為2.50×106／ml)分別加入到上述各培養(yǎng)基組合中,共計(jì)128孔,另外10份加入到隨機(jī)培養(yǎng)基組合中,作為計(jì)數(shù)對(duì)照孔,培養(yǎng)14天,根據(jù)生長(zhǎng)情況傳代。分別記錄7天和14天細(xì)胞數(shù)量。 2.3最佳體系擴(kuò)增后檢測(cè) 配置最佳培養(yǎng)體系：DMEM培養(yǎng)基(含10%自體血清,40μg/mL注射用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素,50ng/ml注射用TPO,10ng／ml白細(xì)胞介素3,2mg／ml注射用鹽酸頭孢甲肟)。 2.3.1最佳擴(kuò)增體系培養(yǎng)前后細(xì)胞表面CD117、CD184標(biāo)記的變化采集8例肝硬化患者骨髓,經(jīng)密度梯度離心后,留取Percoll濃度為50%與40%之間層的細(xì)胞群,于37℃、5% CO2孵育,每3-4天更換1／3量培養(yǎng)基,根據(jù)生長(zhǎng)情況傳代,分別于培養(yǎng)前,培養(yǎng)第7天、第14天留取樣本,在100ul環(huán)境中按1×106細(xì)胞加入20ul PE標(biāo)記抗人CD117直接抗體以及20ul APC標(biāo)記抗人CD184直接抗體孵育20分鐘,600g離心3分鐘,去上清,用1×PBS吹打勻細(xì)胞,600g離心力離心3分鐘,清洗3次,分別進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè),觀察和計(jì)算最佳培養(yǎng)基體系培養(yǎng)7天、14天后,細(xì)胞組分中CD117陽(yáng)性細(xì)胞、CD184陽(yáng)性細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)。 3、人骨髓源性肝干細(xì)胞體外擴(kuò)增后c-Met RNA表達(dá)的變化 3.1分組 擴(kuò)增0天(陰性對(duì)照)、擴(kuò)增7天、擴(kuò)增14天以及肝組織細(xì)胞(陽(yáng)性對(duì)照) 3.2引物設(shè)計(jì)合成 GenBank上查找目的基因mRNA序列,在CDS區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物。設(shè)計(jì)引物所用軟件名稱：Primer express 2.0軟件,序列如下： Sequence Name:H-HGFR(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度101bp) Forward Primer:5'-GCT GGA ACA CCC AGA TTG TTT C-3' Reverse Primer:5'-CGA CAA CTA GAG CCA TGT TGA TG-3' Sequence Name:H-β-actin(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度106bp) Forward Primer:5'-GCA TGG GTC AGA AGG ATT CCT-3' Reverse Primer:5'-TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT-3' 細(xì)胞總RNA的提取,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(反應(yīng)條件：37℃1h,然后95℃3分鐘),熒光定量PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件為：93℃3分鐘,然后93℃30秒,55℃45秒,72℃45秒,共40循環(huán))。 3.3計(jì)算各細(xì)胞群HGFR/c-Met mRNA的表達(dá)水平與內(nèi)參基因H-β-actin比值 反應(yīng)結(jié)束后,由電腦自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果。結(jié)果拷貝數(shù),用B表示,即B=拷貝數(shù)/μl cDNA�？紤]到各個(gè)樣本總RNA濃度的差異,最終計(jì)算結(jié)果按下列公式換算：A=Bl(目的基因)÷B2(內(nèi)參基因),A則為HGFR/c-Met mRNA的表達(dá)水平與內(nèi)參基因H-β-actin比值。 4.統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)用X±S表示。應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。分析各層細(xì)胞比例的差別時(shí),檢驗(yàn)方法采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多樣本比較的秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis H檢驗(yàn))；確定細(xì)胞擴(kuò)增最佳體系時(shí),采用多因素方差分析F檢驗(yàn),檢驗(yàn)4個(gè)主因素對(duì)細(xì)胞數(shù)的影響,兩兩比較用Benforroni法；最佳培養(yǎng)基體系培養(yǎng)的情況時(shí),經(jīng)方差齊性檢驗(yàn),方差齊的,第0天組與第7天組擴(kuò)增倍數(shù)比較,采用單樣本t檢驗(yàn)與第0天比較,第0天擴(kuò)增倍數(shù)為1,第7天組與第14天組擴(kuò)增倍數(shù)比較,方差齊時(shí)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),方差不齊時(shí)采用兩獨(dú)立樣本的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；分析各組細(xì)胞c-Met mRNA表達(dá)水平的差別時(shí)檢驗(yàn)方法采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多樣本比較的秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis H檢驗(yàn))。以P0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] 1.密度梯度離心后分離出4個(gè)細(xì)胞組分,介于Percoll 40～50%梯度之間的細(xì)胞組分中CD117陽(yáng)性細(xì)胞和CD184陽(yáng)性細(xì)胞比例最高,分別為2.11±0.49%、5.71±1.04%。 2.含10%自體血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體系中加入HGPF40μg/ml、TPO 50 ng/ml、IL-3 10 ng/ml組的擴(kuò)增效果最好,擴(kuò)增7天的CD117陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和CD184陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量分別增加6.55倍和6.20倍,第7天組與第0天組比較擴(kuò)增倍數(shù)有顯著性差異(t=11.257,P=0.000；t=16.664,P=0.000),擴(kuò)增14天的CD117陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和CD184陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量分別增加11.62倍和20.57倍,第14天組與第7天組比較擴(kuò)增倍數(shù)有顯著性差異(t=6.936,P=0.000;t=18.322,P=0.000)。 3.與內(nèi)參基因H-β-actin之比,經(jīng)上述最佳培養(yǎng)基體系培養(yǎng)擴(kuò)增0天、7天、14天和正常肝組織c-Met RNA表達(dá)水平c-Met/H-β-actin分別為0.016±0.005、1.873±1.954、0.340±0.113和0.140±0.086(x2=21.651,P=0.000),第7天HGFR/c-Met mRNA表達(dá)水平最高,呈現(xiàn)第7天升高,隨后第14天時(shí)下降,肝細(xì)胞次之。 [結(jié)論] 1)人骨髓有核細(xì)胞經(jīng)Percoll密度梯度離心后,位于40%與50% Percoll層之間的細(xì)胞群CD117陽(yáng)性和CD184陽(yáng)性的細(xì)胞比例最高。 2)含10%自體血清的高糖DMEM培養(yǎng)基體系中加入HGPF40μg/ml、TPO 50 ng/ml、IL-310 ng/ml是體外擴(kuò)增骨髓源性肝干細(xì)胞的可行方案；按以上培養(yǎng)方案,7天時(shí)CD117陽(yáng)性細(xì)胞和CD184陽(yáng)性細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)分別達(dá)到6.55倍和6.20倍,14天時(shí)CD184陽(yáng)性細(xì)胞和CD117陽(yáng)性細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)分別為11.62倍和20.57倍。臨床應(yīng)用本方案擴(kuò)增骨髓源性肝干細(xì)胞可以顯著減少抽取骨髓的需要量。 3) BMDLSC細(xì)胞經(jīng)上述擴(kuò)增方案擴(kuò)增0天、7天、14天后,細(xì)胞的c-Met RNA表達(dá)水平表現(xiàn)為先上升后下降,分別為0.016±0.005、1.873±1.954、0.340±0.113,提示細(xì)胞在擴(kuò)增過(guò)程中可能存在分化,體外擴(kuò)增的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。
【圖文】：

A:骨髓經(jīng)密度梯度離心結(jié)合流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法分離后CD】】7陽(yáng)性細(xì)胞和CD184陽(yáng)性細(xì)胞比例;B:分離前骨髓有核細(xì)胞作為對(duì)照F19.2一1ArePresentsCDI17andCD184eellsrateseParatedfromfreshbonemarrowinthewayofdensitygradienteentrifugationwithfioweytometry，，andB15eontrolbeforeseParation.3.3培養(yǎng)基添加各種因子組合培養(yǎng)7天和14天后的細(xì)胞密度比較總樣本量為128，分別培養(yǎng)7天和14天，共256孔，經(jīng)正交設(shè)計(jì)結(jié)果如表2一1;添加血清組與不添加血清組細(xì)胞密度比較見(jiàn)表2一2;培養(yǎng)基添加不同濃度HGPF培養(yǎng)7天和14天后的細(xì)胞密度見(jiàn)表2一3;培養(yǎng)基添加不同濃度的TPO培養(yǎng)7天和14天后的細(xì)胞密度見(jiàn)表2一4;培養(yǎng)基添加不同濃度的IL一3培養(yǎng)7天和14天后的細(xì)胞密度見(jiàn)表2一5。表2一1正交設(shè)計(jì)分析影響細(xì)胞數(shù)的各主效應(yīng)統(tǒng)計(jì)量和概率Tab.2一1Probabilityandstatisticoforthogonaldesignforanalysisingmaineffee
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 唐浩;廖彩仙;周杰;金浩生;譚遠(yuǎn)飛;蘇俊;張春興;張守華;;小鼠c-Kit~+lin-骨髓細(xì)胞移植生成肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2006年05期

2 秦安成;廖彩仙;王宇;袁杰;黃勇平;廖欣鑫;賴勇強(qiáng);龔祖元;;自體骨髓源性肝干細(xì)胞移植治療肝炎后肝硬化的臨床研究[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年03期

3 廖彩仙;唐浩;周杰;蘇俊;張春興;張守華;;小鼠骨髓CD90+、CD34+、CD117+和Sca-1+細(xì)胞的肝干細(xì)胞潛能比較[J];肝膽外科雜志;2006年06期

4 唐瑟,李運(yùn)星,王嵋景,楊崇禮;多種細(xì)胞因子組合對(duì)臍血干/祖細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2003年03期

5 趙翔宇,常英軍,黃曉軍;rhG-CSF體內(nèi)應(yīng)用對(duì)骨髓和外周血造血干/祖細(xì)胞上CXCR-4表達(dá)的影響[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2005年05期

6 張春興;廖彩仙;張守華;蘇俊;賴勇強(qiáng);周杰;;白細(xì)胞介素3對(duì)c-kit~+Lin~-細(xì)胞的增殖作用[J];江蘇醫(yī)藥;2008年08期

7 姚鵬,胡大榮,王帥,聞煒,周一鳴,龔麗娟;自體骨髓干細(xì)胞移植治療慢性肝衰竭研究[J];肝臟;2005年03期

8 張守華;廖彩仙;張春興;蘇俊;賴勇強(qiáng);周杰;;不同細(xì)胞因子組合對(duì)c-kit~+Lin~-細(xì)胞的體外擴(kuò)增研究[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2008年12期

9 Ko Saito;Masahide Yoshikawa;Yukiteru Ouji;Kei Moriya;Mariko Nishiofuku;Shigehiko Ueda;Noriko Hayashi;Shigeaki Ishizaka;Hiroshi Fukui;;Promoted differentiation of cynomolgus monkey ES cells into hepatocyte-like cells by co-culture with mouse fetal liver-derived cells[J];World Journal of Gastroenterology;2006年42期

本文編號(hào)：2611140