【摘要】：目的本研究通過設計和合成針對抗肝纖維化關鍵基因的結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)特異性小分子干擾RNA (small interfering RNA, siRNA),并通過細胞轉染篩選出高效的CTGFsiRNA抗肝纖維化序列,探討通過尾靜脈注射CTGF siRNA觀察對大鼠肝纖維化肝臟功能及肝纖維化指標的影響及是否能抑制大鼠體內(nèi)肝臟CTGF基因表達防治大鼠肝纖維化。 方法1.參照siRNA設計原則,應用RNA在線設計軟件,設計3段RNA干擾候選序列,分別轉染正常肝細胞株(L-02),以轉染非特異性siRNA(與CTGF mRNA無同源性)作為對照,應用Western Blot檢測L-02細胞CTGI蛋白質(zhì)表達,根據(jù)蛋白表達結果篩選出高效的CTGI干擾序列。2.雄性SD大鼠30只,隨機分成5組,分別為模型組：腹腔注射40%CCl1 (3ml/kg)及尾靜脈注射生理鹽水,1次/3d,連續(xù)8周；預防組：腹腔注射40%CCl1及尾靜脈注射抗CTGF siRNA (0.1mg/kg),1次/3d,連續(xù)8周；治療組：腹腔注射40%CCl1 2周,后給予抗CTGF siRNA及CCl1 6周；晚期治療組：腹腔注射40%CCl1 4周,后給予抗CTGF siRNA及CCl1 4周；空白對照組：尾靜脈注射生理鹽水8周。于最后一次CCl1注射3天后取血及組織標本,檢測血清轉氨酶(ALT、AST)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)及肝纖維化(透明質(zhì)酸HA、層黏連蛋白LN、人Ⅲ型前膠原h(huán)pcⅢ、Ⅳ型膠原Ⅳ.C)指標,應用Real-Time PCR及western-blot印跡法檢測CTGF mRNA及蛋白質(zhì)在大鼠肝組織表達,應用H-E染色檢測肝組織炎癥及纖維化,參照慢性肝炎分級分期標準對大鼠肝臟炎癥活動度及肝纖維化程度進行病理分級。 結果1.與對照相比,轉染siRNA的L-02細胞CTGF蛋白表達明顯下調(diào),且siCTGF-1、siCTGF-2、siCTGF-3各片段干擾率分別為44.91%、93.99%、81.34%,其中以siCTGF-2干擾率最高,效果最明顯。轉染非特異性siRNA的L-02細胞CTGF蛋白表達無明顯變化(p0.05)。2.與模型組相比預防組及治療組大鼠肝組織CTGF mRNA及蛋白質(zhì)表達顯著下調(diào)(p0.05),肝組織炎癥、壞死及纖維化明顯減輕,血清轉氨酶、肝纖維化指標顯著降低。晚期治療組與模型組相比大鼠肝組織CTGF mRNA及蛋白質(zhì)表達下調(diào)(p0.05),肝組織炎癥、壞死及纖維化減輕,血清轉氨酶、肝纖維化指標降低,與預防組及治療組相比大鼠肝組織CTGF mRNA及蛋白質(zhì)表達相對上調(diào)(p0.05),肝組織炎癥、壞死及纖維化程度相對增加,血清轉氨酶、肝纖維化指標相對升高。 結論不同的CTGF siRNA對L-02細胞CTGF表達水平具有不同的干擾效能,成功合成能高效阻抑CTGF表達的CTGFsiRNA。經(jīng)尾靜脈注射抗CTGF siRNA能顯著抑制大鼠體內(nèi)肝臟CTGF基因表達并能有效防治大鼠肝纖維化,注射越早,越有效的阻止肝纖維化的進展,且對于病程較長的肝纖維化也有一定的治療作用,提示抗CTGF siRNA將成為抗肝纖維化治療的新靶點。
【圖文】：

次州少、學碩曰){究’!月襯洲侖丈結果TGFsiRNA對L一02細胞CTGF蛋白表達的干擾效果:westemBlot結果纖計算機灰度掃描少尸、內(nèi)參(p一actill)比較分析顯示。轉染SICTGF一1、SICTGF一2、SICTGF一3，「士)CJ舌，CTGF蛋白表達分另x!為(53l)、(6.18士().32)、(18.66士1.()9)，與又、l‘}線毛」‘!!t匕，轉染siRNAf內(nèi)L一0TGF蛋自表達明顯卜調(diào)(p<0.()5)。然后將colltro!(空自對照)紅}比值100%，分別得到SICTGF一1、SICTGF一2、SICTGF一3各片段干擾率為44.9側，、剮.34嘆，，工U中以、iCTGF一2廠「擾率最高，效果最明異轉染汗特異性SIR一02細胞CTGF蛋白表達無明顯變化(p<0.()5)。

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【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

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1 孫魯琨;王貴波;;肝纖維化機制研究進展[J];西南國防醫(yī)藥;2009年12期

本文編號：2610639