發(fā)布時間：2020-04-01 08:45

【摘要】： 胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells,PSCs)位于胰腺小葉間和腺泡周圍區(qū),圍繞鄰近腺細胞基底部,與慢性胰腺炎和胰腺癌密切相關(guān)的一類肌成纖維細胞樣細胞。在未損傷的胰腺組織中,胰腺星狀細胞呈靜止狀態(tài),胞內(nèi)富含Vit A脂滴和油脂酸視黃醇,具有攝取和酯化視黃醇的能力,結(jié)蛋白(desmin)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)染色陽性。當胰腺受損后,胰腺星狀細胞活化,發(fā)生形態(tài)學和功能學的雙重變化,表現(xiàn)為:細胞體積變大,增殖活躍;脂質(zhì)丟失;僅α-平滑肌肌動蛋白(alpha-SMA)表達陽性;對細胞因子如血小板衍生生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)反應(yīng)性增加;分泌細胞外基質(zhì)(ECM),尤其是Ⅰ、Ⅲ型膠原。 慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)是指由于各種不同病因引起的胰腺組織和功能的持續(xù)性損害,其特征為胰腺基本結(jié)構(gòu)發(fā)生永久性改變,廣泛纖維化,即使病因已去除仍常伴胰腺的功能性缺陷。臨床上以反復(fù)發(fā)作的上腹部疼痛和胰腺外分泌功能不全為主要特征,可合并胰腺內(nèi)分泌功能不全、胰腺實質(zhì)鈣化、胰管結(jié)石和胰腺假性囊腫形成。慢性胰腺炎病程遷延,臨床表現(xiàn)多樣,嚴重影響患者的日常生活。并且有報道認為慢性胰腺炎是胰腺癌的危險因素之一。但目前對慢性胰腺炎的病因、發(fā)病機制尚不甚清楚,慢性胰腺炎的治療更為棘手。 胰腺纖維化的形成是一個由復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)通路所介導(dǎo)的、以胰腺星狀細胞活化為中心、多種細胞因子與炎性介質(zhì)參與的、最終以成纖維細胞增生和細胞外基質(zhì)(ECM)沉積為特征的復(fù)雜的病理發(fā)展過程。胰腺星狀細胞活化是胰腺纖維化發(fā)生的關(guān)鍵步驟,因此抑制胰腺星狀細胞活化在抗胰腺纖維化過程中占有重要地位。 體內(nèi)外實驗均證實細胞因子、乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛、氧應(yīng)激等能促進胰腺星狀細胞活化�；罨囊认傩菭罴毎置贓CM成分,促進胰腺纖維化形成。在胰腺星狀細胞活化通路中,絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)信號傳遞途徑是最為重要一條。ERK通路的主要功能是介導(dǎo)有絲分裂信號向胞核傳遞,調(diào)控細胞的生長。Jaster等在研究細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)通路與PSC活化的關(guān)系時,發(fā)現(xiàn)不同轉(zhuǎn)化階段的PSC都能持續(xù)表達磷酸化的Smads;血小板衍生生長因子(PDGF)在促進PSC增殖的同時增加ERK通路成分的表達;應(yīng)用Trapidil或PD98059(MAPK激酶的抑制劑)均可以抑制PSC的增殖。這也證實ERK通路在PSC的活化中起到了重要作用。 丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal-B),又稱丹參酚酸B或丹酚酸乙,是唇形科植物丹參Salvia Miltiorrhiza Bge.的根及根莖提取而得,為三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合而成。丹酚酸B具有活血化瘀,通經(jīng)活絡(luò)之功效,是目前研究較多的丹酚酸之一,對心、腦、肝、腎等器官均具有重要藥理作用。藥理學研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B具有很強的抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤作用,抑制血小板聚集和抑制血栓形成作用,并能延長缺氧條件下動物的存活時間。實驗證明,丹酚酸B能抑制TGF-β的肝星狀細胞胞(HSC)內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其受體蛋白的表達,拮抗TGF-β的促HSC活化,還能抑制HSC增殖和膠原合成。 我們試圖通過丹酚酸B灌胃治療大鼠慢性胰腺炎模型,觀察血液生化指標、胰腺病理改變、胰腺星狀細胞激活狀態(tài)和膠原蛋白的表達,初步闡明丹酚酸B對慢性胰腺炎的保護作用及可能機制。并且通過丹酚酸B干預(yù)大鼠胰腺星狀細胞,觀察胰腺星狀細胞活化,膠原蛋白和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)表達水平,進一步闡明丹酚酸B對胰腺星狀細胞的保護作用及機制。 方法: 1)動物模型建立與胰腺星狀細胞評價 雄性大鼠行膽胰管注射2%TNBS乙醇磷酸鹽緩沖液誘導(dǎo)慢性胰腺炎模型,分別于術(shù)后2周4周和8周處死大鼠行胰腺病理學檢查,采用文獻報道的胰腺組織學評分方法,主要評價胰腺腺泡細胞萎縮,纖維化和炎癥細胞浸潤;免疫組化檢測胰腺星狀細胞活化的情況;RT-PCR檢測Ⅰ膠原蛋白mRNA表達水平。同時設(shè)立相應(yīng)的對照組。 2)丹酚酸B動物試驗 雄性大鼠行膽胰管注射2%TNBS乙醇磷酸鹽緩沖液誘導(dǎo)慢性胰腺炎模型,分為模型對照組(組1)和丹酚酸B治療組(組2),組3是膽胰管注射乙醇磷酸鹽緩沖液的對照組(非模型對照組),組4是假手術(shù)組。30只大鼠膽胰管注射2%TNBS乙醇磷酸鹽緩沖液誘導(dǎo)慢性胰腺炎模型,12只大鼠膽胰管注射乙醇磷酸鹽緩沖液,12只大鼠接受假手術(shù)。每組各取10只大鼠進入正式實驗,第5周開始,組2接受每天10mg/kg體重的丹酚酸B灌胃治療,組1、組3和組4接受等體積的生理鹽水灌胃,共治療8周。治療結(jié)束時抽取血標本,分離血清,行血清生化和纖維化指標檢測;同時分離胰腺稱重,并取胰腺組織中性福爾馬林固定用于形態(tài)學研究;免疫組化檢測胰腺星狀細胞活化的情況;取部分胰腺組織抽提總RNA檢測Ⅰ膠原蛋白mRNA表達水平。 3)細胞增殖抑制試驗 采用MTT方法,取對數(shù)生長期的細胞PSC(LTC-14,德國Robert Jaster教授澇?,用0.25%胰酶消化為單個細胞,作細胞計數(shù),以培養(yǎng)液稀釋為終濃度為2×10~4/ml的單細胞懸液,每孔190ul接種于96孔培養(yǎng)板中,置37℃、5%CO_2培養(yǎng)箱中過夜,待細胞貼壁后進行試驗。將稀釋為不同濃度的丹酚酸B 10ul分別加入各孔中(終濃度為1μmol/L,10μmol/L,100μmol/L),每個濃度設(shè)5個復(fù)孔,并設(shè)只加細胞不加藥液的對照孔和只加培養(yǎng)液的調(diào)零孔。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后,進行MTT檢測。選擇570nm波長,在免疫酶標儀上比色測定OD值,記錄結(jié)果。 4)丹酚酸B細胞試驗 取對數(shù)生長期LTC-14細胞,消化為單個細胞,以培養(yǎng)液稀釋為終濃度為1×10~5/ml的單細胞懸液,每孔接種4×10~4的單細胞懸液于6孔培養(yǎng)板中,置37℃、5%CO_2培養(yǎng)箱中過夜,待細胞貼壁后進行試驗。將稀釋為不同濃度的丹酚酸B加入各孔中(終濃度為1μmol/L,10μmol/L,100μmol/L),以等體積的PBS作為對照。培養(yǎng)48小時后收集細胞抽提總RNA行RT-PCR檢測alpha-平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達水平。免疫印跡檢測Ⅰ型膠原蛋白和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)表達水平。 結(jié)果: 1)動物模型建立與胰腺星狀細胞評價 膽胰管注射TNBS成功誘導(dǎo)慢性胰腺炎,術(shù)后第2周胰腺組織有炎癥細胞浸潤,未見明顯萎縮和纖維化,免疫組化提示少量alpha-平滑肌肌動蛋白陽性細胞,第4周胰腺組織表面蒼白、不規(guī)則、結(jié)節(jié)狀,膽胰管明顯擴張,內(nèi)含淡黃色液體;HE染色光鏡觀察胰管周圍、小葉間和小葉內(nèi)廣泛纖維化,伴炎癥細胞浸潤,局灶腺體萎縮,免疫組化明顯alpha-平滑肌肌動蛋白陽性細胞,第8周胰腺組織改變與第4周相似,但病理該變更嚴重,alpha-平滑肌肌動蛋白陽性細胞更多。術(shù)后第2周胰腺組織Ⅰ型膠原蛋白mRNA水平已經(jīng)升高,第4周胰腺組織Ⅰ型膠原蛋白mRNA水平明顯升高,第8周升高幅度更大。 2)丹酚酸B動物試驗 (1)丹酚酸B改善大鼠慢性胰腺炎模型病理形態(tài):第12周末,模型對照組大鼠胰腺腺泡萎縮、間質(zhì)水腫、炎癥細胞浸潤和纖維化明顯。丹酚酸B可以明顯改善胰腺組織病理損害。與模型對照組和丹酚酸B治療組比較,非模型對照組和假手術(shù)組大鼠胰腺無或僅有輕微病理損害。模型對照組大鼠胰腺的組織病理學評分明顯高于丹酚酸B治療組(p＜0.01)。丹酚酸B治療組大鼠胰腺的腺泡萎縮和纖維化評分明顯低于模型對照組(p＜0.05),而炎癥細胞浸潤評分沒有差別(p＞0.05)。 (2)丹酚酸B抑制大鼠慢性胰腺炎模型的胰腺星狀細胞活化:模型對照組大鼠胰腺中有明顯的alpha-SMA陽性細胞。與模型對照組和丹酚酸B治療組比較,非模型對照組和假手術(shù)組大鼠胰腺僅有少數(shù)alpha-SMA陽性細胞。丹酚酸B治療組大鼠胰腺的alpha-SMA陽性細胞明顯少于模型對照組。 (3)丹酚酸B抑制慢性胰腺炎模型胰腺組織Ⅰ膠原蛋白mRNA表達:與模型對照組比較,丹酚酸B可以明顯抑制胰腺組織Ⅰ膠原蛋白mRNA表達(p＜0.01)。與非模型對照組和假手術(shù)組大鼠相比,模型對照組大鼠的胰腺組織Ⅰ膠原蛋白mRNA水平明顯升高(p＜0.01),而丹酚酸B治療組大鼠的胰腺組織Ⅰ膠原蛋白mRNA升高水平?jīng)]有統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。 3)胰腺星狀細胞增殖抑制試驗 根據(jù)MTT結(jié)果,丹酚酸B1μmol/L組對PSC細胞沒有明顯的增殖抑制作用(p＞0.05),而丹酚酸B10μmol/L和100μmol/L組與對照組相比,丹酚酸B對PSC細胞有明顯的增殖抑制作用(p＜0.01)。 4)丹酚酸B細胞試驗 (1)丹酚酸B抑制胰腺星狀細胞alpha平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達:與對照組相比,丹酚酸B組胰腺星狀細胞alpha平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達明顯下調(diào),而且隨著丹酚酸B1μmol/L,10μmol/L和100μmol/L逐步升高,胰腺星狀細胞alpha平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達逐步下調(diào)。 (2)丹酚酸B抑制胰腺星狀細胞Ⅰ型膠原蛋白表達:與對照組相比,丹酚酸B1μmol/L組胰腺星狀細胞Ⅰ型膠原蛋白表達沒有下調(diào),但丹酚酸B10μmol/L和100μmol/L組胰腺星狀細胞Ⅰ型膠原蛋白表達明顯下調(diào),且隨著丹酚酸B濃度升高,胰腺星狀細胞Ⅰ型膠原蛋白表達逐步下調(diào)。 (3)丹酚酸B抑制胰腺星狀細胞細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)表達:與對照組相比,丹酚酸B組胰腺星狀細胞細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)表達明顯下調(diào),而且隨著丹酚酸B1μmol/L,10μmol/L和100μmol/L逐步升高,胰腺星狀細胞細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)表達逐步下調(diào)。 結(jié)論: 1)膽胰管注射法誘導(dǎo)的慢性胰腺炎模型基本符合人類慢性胰腺炎特征,胰腺星狀細胞在慢性胰腺炎發(fā)生發(fā)展中起重要作用; 2)丹酚酸B通過抑制胰腺星狀細胞細胞外信號調(diào)節(jié)激酶活性,降低alpha平滑肌肌動蛋白mRNA表達水平和抑制胰腺星狀細胞活化; 3)丹酚酸B通過抑制胰腺星狀細胞活化,減少Ⅰ膠原蛋白和改善慢性胰腺炎大鼠模型胰腺組織病理損害。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R576

【共引文獻】

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本文編號：2610225