【摘要】：第一部分肝X受體α啟動子蟲螢光素酶質粒的構建 目的：本部分旨在構建人類肝X受體α啟動子的蟲熒光素酶重組質粒。 方法：以HepG2細胞DNA為模板擴增肝X受體α啟動子序列，將擴增產物經限制性內切酶雙酶切后與同樣雙酶切的pGL3-Basic載體進行連接并進行鑒定。 結果：將重組質粒進行雙酶切鑒定及測序分析證明成功構建了LXRα啟動子的熒光素酶報告質粒（pGL3-Basic-LXRα-P）。 結論：利用已知的啟動子序列結合生物信息學資源能準確快速的構建出啟動子蟲熒光素酶重組質粒。 第二部分在HepG2細胞中探討炎癥因子對肝X受體α啟動子活性的影響 目的：在HepG2細胞中觀察炎癥因子對肝X受體α啟動子活性的影響，從而探討HepG2細胞內膽固醇積聚的分子機制。 方法：將構建的LXRα基因啟動子的蟲熒光素酶報告質粒轉染HepG2細胞同時轉染海腎熒光素酶報告基因載體pRL-TK作內參照，利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測炎癥因子對LXRα啟動子活性的影響，進一步將HepG2細胞分為對照組（control）、炎癥組（TNFα20ng/ml）、高脂組（LDL,100ug/ml）及聯(lián)合處理組（TNFα20ng/ml+LDL100ug/ml）。采用實時定量PCR和Western Blot檢測HepG2細胞中LXRα、ABCG1、ABCA1基因mRNA和蛋白的表達水平。用油紅O染色和定量比色法分析HepG2細胞內膽固醇的含量。 結果：炎癥因子能明顯抑制LXRα啟動子的活性。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，炎癥因子下調了LXRα、ABCA1、 ABCG1mRNA與蛋白表達。油紅O染色和定量結果顯示，炎癥因子使細胞內脂質明顯增加。 結論：炎癥因子可能通過抑制LXRα啟動子活性，，干擾LXRα受體途徑從而抑制HepG2細胞內膽固醇的外流，導致肝細胞內脂質異常積聚。 第三部分在HMCs細胞中探討炎癥因子對肝X受體α啟動子活性的影響 目的：在HMCs細胞中觀察炎癥因子對肝X受體α啟動子活性的影響，從而探討HMCs細胞內膽固醇積聚的分子機制。 方法：將構建的LXRα啟動子的蟲熒光素酶報告質粒與海腎熒光素酶報告基因載體共轉染至HMCs中，采用雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)觀察炎癥因子對LXRα啟動子活性的影響，進一步將HMCs細胞分為對照組（control）、炎癥組（TNFα20ng/ml）、高脂組（LDL,100ug/ml）及聯(lián)合處理組（TNFα20ng/ml+LDL100ug/ml）。采用實時定量PCR和Western Blot檢測HMCs細胞中LXRα、ABCA1基因mRNA和蛋白表達水平。用油紅O染色和定量比色法分析HMCs細胞內膽固醇的含量。 結果：炎癥因子能明顯抑制LXRα啟動子的活性。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，炎癥因子下調了LXRα與ABCA1mRNA與蛋白表達。油紅O染色和定量結果顯示，炎癥因子使細胞內脂質明顯增加。 結論：炎癥因子可能通過抑制LXRα啟動子活性，干擾LXRα受體途徑從而抑制HMCs細胞內膽固醇的外流，導致腎臟細胞內脂質異常積聚。
【圖文】：

LXRα的啟動子片段

圖 2.2 PCR 篩選重組質粒 2.2 Screening of recombinant plasmid bM DNA Marker2 Positive colony
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R575.5

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 孫曉紅,陳明杰,潘迎捷;啟動子克隆概述[J];食用菌學報;2002年03期

2 李琦;周利紅;王炎;孫玨;高虹;范忠澤;;pGL3-Basic-COX-2-promoter報告基因重組質粒的構建及其功能鑒定[J];世界華人消化雜志;2008年31期

3 楊曉娜;趙昶靈;李云;李會容;蘇麗;周燕瓊;;啟動子序列克隆和功能分析方法的研究進展[J];云南農業(yè)大學學報(自然科學版);2010年02期

本文編號：2609652