【摘要】：第一部分肝X受體α啟動(dòng)子蟲螢光素酶質(zhì)粒的構(gòu)建 目的：本部分旨在構(gòu)建人類肝X受體α啟動(dòng)子的蟲熒光素酶重組質(zhì)粒。 方法：以HepG2細(xì)胞DNA為模板擴(kuò)增肝X受體α啟動(dòng)子序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切后與同樣雙酶切的pGL3-Basic載體進(jìn)行連接并進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定及測(cè)序分析證明成功構(gòu)建了LXRα啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（pGL3-Basic-LXRα-P）。 結(jié)論：利用已知的啟動(dòng)子序列結(jié)合生物信息學(xué)資源能準(zhǔn)確快速的構(gòu)建出啟動(dòng)子蟲熒光素酶重組質(zhì)粒。 第二部分在HepG2細(xì)胞中探討炎癥因子對(duì)肝X受體α啟動(dòng)子活性的影響 目的：在HepG2細(xì)胞中觀察炎癥因子對(duì)肝X受體α啟動(dòng)子活性的影響，從而探討HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇積聚的分子機(jī)制。 方法：將構(gòu)建的LXRα基因啟動(dòng)子的蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染海腎熒光素酶報(bào)告基因載體pRL-TK作內(nèi)參照，利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)炎癥因子對(duì)LXRα啟動(dòng)子活性的影響，進(jìn)一步將HepG2細(xì)胞分為對(duì)照組（control）、炎癥組（TNFα20ng/ml）、高脂組（LDL,100ug/ml）及聯(lián)合處理組（TNFα20ng/ml+LDL100ug/ml）。采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot檢測(cè)HepG2細(xì)胞中LXRα、ABCG1、ABCA1基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。用油紅O染色和定量比色法分析HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量。 結(jié)果：炎癥因子能明顯抑制LXRα啟動(dòng)子的活性。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照組相比，炎癥因子下調(diào)了LXRα、ABCA1、 ABCG1mRNA與蛋白表達(dá)。油紅O染色和定量結(jié)果顯示，炎癥因子使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)明顯增加。 結(jié)論：炎癥因子可能通過抑制LXRα啟動(dòng)子活性，，干擾LXRα受體途徑從而抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常積聚。 第三部分在HMCs細(xì)胞中探討炎癥因子對(duì)肝X受體α啟動(dòng)子活性的影響 目的：在HMCs細(xì)胞中觀察炎癥因子對(duì)肝X受體α啟動(dòng)子活性的影響，從而探討HMCs細(xì)胞內(nèi)膽固醇積聚的分子機(jī)制。 方法：將構(gòu)建的LXRα啟動(dòng)子的蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與海腎熒光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染至HMCs中，采用雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)觀察炎癥因子對(duì)LXRα啟動(dòng)子活性的影響，進(jìn)一步將HMCs細(xì)胞分為對(duì)照組（control）、炎癥組（TNFα20ng/ml）、高脂組（LDL,100ug/ml）及聯(lián)合處理組（TNFα20ng/ml+LDL100ug/ml）。采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot檢測(cè)HMCs細(xì)胞中LXRα、ABCA1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平。用油紅O染色和定量比色法分析HMCs細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量。 結(jié)果：炎癥因子能明顯抑制LXRα啟動(dòng)子的活性。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照組相比，炎癥因子下調(diào)了LXRα與ABCA1mRNA與蛋白表達(dá)。油紅O染色和定量結(jié)果顯示，炎癥因子使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)明顯增加。 結(jié)論：炎癥因子可能通過抑制LXRα啟動(dòng)子活性，干擾LXRα受體途徑從而抑制HMCs細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流，導(dǎo)致腎臟細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常積聚。
【圖文】：

LXRα的啟動(dòng)子片段

圖 2.2 PCR 篩選重組質(zhì)粒 2.2 Screening of recombinant plasmid bM DNA Marker2 Positive colony
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R575.5

【參考文獻(xiàn)】

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2 李琦;周利紅;王炎;孫玨;高虹;范忠澤;;pGL3-Basic-COX-2-promoter報(bào)告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其功能鑒定[J];世界華人消化雜志;2008年31期

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本文編號(hào)：2609652